細胞培養實戰指南之細胞復蘇、細胞傳代、細胞凍存等事項

細胞復蘇

液氮中取出的細胞，待液氮揮發后，馬上將細胞凍存管置于37℃水浴中輕輕搖動使快速融化（盡量控制在2min內，時間過長了可能會影響細胞的狀態）。在解凍時，凍存管瓶口盡量控制在水面以上。

解凍后，將凍存管轉移到無菌操作臺，75%酒精擦拭凍存管外部。

將細胞懸液轉移至，裝有37℃預熱的培養基離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘，棄上清。

重新加入經預熱培養基重懸細胞，以適宜密度，一般約為(3~5)×10^5個/ml密度接種到培養器皿（直徑10cm）中。

放到37℃孵育，第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。

細胞傳代

用移液器吸取并丟棄使用過的細胞培養基（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導致易污染），并用PBS緩慢沖洗細胞2次。

以直徑10cm的培養皿為例，向培養皿中加入500μl胰蛋白酶-EDTA（根據各細胞的使用說明，選擇合適的濃度）消化液，輕輕搖動培養皿，使消化液流遍所有細胞表面，放到37 ℃ 孵育（一般2分鐘左右即可）。鏡下觀察，發現胞質回縮、細胞間隙增大，傾斜培養瓶時細胞層能自然流即可終止，此時應加入2-3ml含血清的完全培養液終止消化（細胞的解離時間標準可能偏差，根據細胞來源確定，有些細胞屬于半貼壁，無需胰蛋白酶也可解離）。

吸取所有培養皿內的液體，沿培養皿底部緩慢吹打，重復該動作2-3次，使所有細胞沿瓶底流下，再輕柔地把細胞吹打成單個懸液（吹打過程中應盡量避免氣泡的產生）。

把所有的細胞懸液轉移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后棄上清。

加入培養基重懸成單細胞懸液。按實驗所需的細胞量添加到新的培養皿中，將培養皿37 ℃ 孵育，每天觀察細胞的貼壁情況。

注意：向培養皿加液體時，建議從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層，前后搖晃容器數次，最后移棄沖洗液。若是懸浮細胞傳代培養，過程中省消化步驟。

細胞凍存

按照“細胞傳代”中的步驟收集細胞。

加入細胞凍存液（一般10%DMSO+對應細胞的培養基），重懸細胞，使細胞的終密度為(5~10)×10^5個/ml，移入細胞凍存管中。

程序降溫，更推薦使用程序降溫盒。若手動進行降溫，凍存的一般程序為降溫速率1～2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可將降溫速度增加至5℃～10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。