新技術！多用途和低成本的靶向長讀RNA測序技術

在從基因到蛋白質的過程中，RNA分子在被翻譯成蛋白質之前可以被切割并以不同的方式連接。這個過程被稱為選擇性剪接，它允許一個基因編碼幾種不同的蛋白質。雖然選擇性剪接發生在許多生物過程中，但它可能在癌癥等疾病中失調，導致致病性RNA分子。為了了解選擇性剪接是如何導致疾病的，研究人員需要對單個基因產生的所有RNA分子(稱為“轉錄異構體”)進行準確的計算。

這樣做的一種方法是使用“長讀”RNA測序平臺，它對長度超過10,000個堿基的RNA分子進行端到端測序，捕獲整個轉錄異構體。然而，這些長讀平臺的測序產率不高，這阻礙了它們的廣泛采用，特別是在臨床環境中，因為在臨床信息深度生成長讀RNA測序數據可能非常昂貴。靶向測序涉及在測序之前富集感興趣的特定核酸序列，這是一種有用的策略，可以大大提高預定義靶標的覆蓋范圍，但目標捕獲的成本和復雜性一直是廣泛使用的障礙。

“靶向長讀RNA測序是一種強大的策略，可以闡明任何預定義基因的RNA庫。然而，現有的全長RNA分子靶向測序技術要么昂貴，要么難以建立，這使得許多實驗室無法實現，”共同通訊作者、病理學和實驗室醫學助理教授Lan Lin博士說?！癟EQUILA-seq解決了這個問題，因為它既便宜又易于使用。用戶可以根據不同的目的調整這項技術，研究人員可以選擇他們想要測序的基因，并在自己的實驗室中制作用于目標捕獲的試劑。這有可能加速發現針對各種疾病的新診斷和治療方案?！?/span>

一種允許目標測序的方法被稱為雜交捕獲富集，它使用被稱為寡核苷酸的核酸短片段作為捕獲探針。這些寡核苷酸被生物素分子標記，并被設計成基于核酸序列互補性與它們的靶標雜交，這使得從生物樣品中輕松捕獲和分離它們的靶標序列成為可能。然而，盡管基于雜交捕獲的富集是一種有效的靶向測序方法，但商業合成的生物素化捕獲探針價格昂貴，只能用于有限數量的反應，使得每個捕獲反應的每個樣品成本很高。

為了解決這一限制，CHOP的研究人員開發了TEQUILA-seq(利用等溫線性擴增探針與長讀測序相結合的轉錄本富集和定量)。TEQUILA-seq的一個關鍵創新是一種由核酸內切酶觸發的等溫鏈位移擴增反應，該反應可以從廉價的非生物素化寡核苷酸作為模板合成大量的生物素化捕獲探針。使用僅2ng的模板寡核苷酸輸入，研究人員可以產生25ug的TEQUILA探針，它可以用于至少250個捕獲反應。這種合成捕獲探針的創新策略使TEQUILA-seq具有很高的成本效益和可擴展性，適用于大型靶板和許多生物樣品。

為了對其性能進行基準測試，研究人員對合成RNA或人類RNA上的多個基因面板進行了TEQUILA-seq。TEQUILA探針在目標捕獲和富集方面的表現與商業捕獲探針一樣好，而每次捕獲反應的價格便宜數百倍。此外，研究人員證明TEQUILA-seq可以在保持目標RNA分子定量的同時大大提高檢測效果。

“使用便宜的試劑和簡單的實驗流程，TEQUILA-seq使我們能夠對許多生物樣品中的任何基因集的全長RNA分子進行深度測序，”CHOP計算與基因組醫學中心主任、共同資深作者易星博士說?！斑@是非常令人興奮的，它使廣泛的醫學應用成為可能，從RNA引導的基因診斷到治療開發?！?/span>

為了說明其生物醫學用途，研究人員應用TEQUILA-seq分析了40個乳腺癌細胞系中468個可操作的癌癥基因的全長RNA分子。他們在廣泛研究的癌癥基因中發現了以前未知的轉錄異構體，這可能會揭示保護身體免受癌癥侵害的基因如何在個體腫瘤中失活。

“我們的工作表明，TEQUILA-seq可以廣泛用于全長RNA分子的靶向測序，”Lin博士說?！按送?，龍舌蘭探測器是通用捕獲探測器。它們在長讀和短讀測序平臺上兼容靶向RNA和DNA測序。能夠以低成本輕松地為任何目標面板輕松生成大量生物素化捕獲探針，可以為許多基礎，轉化和臨床應用促進大規模和人群水平的研究?！?/span>

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