新研究！新基因編輯工具ModPoKI，有望改善CAR-T細胞療法

近年來，科學家們利用基因修飾技術將免疫細胞重編程為可以攻擊癌癥的療法。但這類免疫療法并非對所有患者或所有癌癥類型都有效，而且篩選每一種可能改善這些經過重編程的免疫細胞的基因變化組合是一項艱巨而緩慢的任務。

如今，在一項新的研究中，來自美國格拉斯通研究所和加州大學舊金山分校的研究人員開發出了一種技術，能讓他們快速“拼接”出數千種不同的基因編輯組合，以便在免疫細胞中進行測試。他們利用這項名為“模塊化集合基因敲除篩選（Modular Pooled Knockin Screening, ModPoKI）”的篩選技術，確定了一種新的基因組合，當將這種基因組合加入免疫細胞后，能使這些細胞的壽命更長，抗癌效果更好。相關研究結果發表在2023年9月14日的Cell期刊上，論文標題為“Modular pooled discovery of synthetic knockin sequences to program durable cell therapies”。

論文共同通訊作者、格拉斯通-加州大學舊金山分校基因組免疫學研究所主任Alexander Marson博士說，“這是我們向前邁出的重要一步，我們有能力提出關于如何將基因程序的片段組合到細胞中并測試它們如何對患者有利的問題。我認為這將加速開發更好的細胞療法。”

論文共同作者、斯坦福大學醫學院病理學系助理教授Ansuman Satpathy博士補充說，“這項新的研究展示了利用高通量基因組學發現和設計細胞療法中新型分子程序的能力，并進一步了解了這些程序對殺死癌癥所需的T細胞狀態的影響。”

混合和匹配部件

免疫系統的 T 細胞在抗癌過程中發揮著關鍵作用。當T細胞通過其表面的受體將癌細胞識別為外來細胞時，它就會靶向破壞癌細胞。科學家們已發現了如何改變 T 細胞上的受體---通常是通過添加編碼人工嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR）的 DNA 序列來實現---這樣 T 細胞就能更容易地識別和消滅癌細胞。

在CAR-T 細胞療法中，癌癥患者的 T 細胞會通過抽血提取，然后在實驗室中對它們進行基因重編程以便引入這些新的 CAR 受體，并重新將它們輸注到患者的血液中。然而，許多CAR-T細胞療法仍有局限性：它們通常對實體瘤無效，隨著時間的推移會磨損，而且有些CAR不能引起足夠強的免疫反應來殺死癌細胞。

論文**作者、Marson實驗室博士后Franziska Blaeschke博士說，“CAR-T細胞在治療白血病和淋巴瘤等血癌方面取得了令人難以置信的成功，但我們仍在尋找優化它們并將其應用于其他癌癥的方法。到目前為止，我們一直缺乏一種系統的方法來發現 T 細胞中哪些基因變化對改善 CAR-T 細胞最有效。”

為了填補這一空白，這些作者開發出了 ModPoKI。該技術將多個基因組合成長長的 DNA 片段，用于 CRISPR 基因編輯平臺。他們利用這一工具，通過將數百個基因與編碼特定 CAR 的 DNA 混合在一起，創造出這些 DNA 長段的約 1 萬種潛在組合。然后，他們利用CRISPR將拼接在一起的DNA序列粘貼到T細胞基因組中的一個確定位置。

每個T細胞都接受了不同的DNA序列，然后這些作者讓這些T細胞互相競賽，看哪個T細胞在各種可以預測抗腫瘤活性的測試中表現**。ModPoKI 生成的每組基因上都有一個易于讀取的 DNA 條形碼，這樣就可以追蹤哪種基因組合能改善 T 細胞。

這種類似樂高積木的能力讓他們能夠在將基因加入細胞之前，以新的方式組合基因，從而迅速發現可能改善 CAR-T 細胞的基因組合，而無需手動選擇和設計每種基因組合。

論文共同通訊作者、Marson實驗室前成員Theodore Roth博士說，“我們不必單獨猜測是什么可以改善細胞的功能，然后一個接一個地進行研究，我們可以把這些片段放在一起，然后非常迅速地連續測試許多細胞。這是分子生物學中非常有用的部分。”

邁向更好的療法

Marson團隊在這項新研究中添加到細胞中的基因是表面受體（天然受體和工程受體，旨在向CAR-T細胞發送增強的信號）和轉錄因子（開啟和關閉其他基因）。在分析數百種表面受體和轉錄因子的測試結果時，這些作者發現不同的CAR可以通過不同的因素進行優化。

Blaeschke 說，“事實證明轉錄因子并不是萬能的。因此，當科學家們在開發新的CAR-T細胞時，有必要檢查一下還有哪些其他因素可以優化CAR-T細胞。我們的研究產生了一種圖譜，科學家們可以使用它將不同的轉錄因子與不同的T細胞受體（T cell receptor, TCR）或CAR結合起來。”

這些作者還確定了兩種似乎經常能改善 CAR-T 細胞的轉錄因子的組合。這兩種轉錄因子---BATF和TFAP4---提高了一種以前曾被開發用于治療兒童腦瘤的CAR-T細胞的適應性。

Marson說，“在實驗室中，帶有 BATF 和 TFAP4 的 ModPoKI 序列使 CAR-T 細胞顯示出提高抗腫瘤活性的潛力。接下來，我們需要開展更多的研究工作，以確定添加這些轉錄因子是否會使CAR-T細胞對人類癌癥患者更有效。”

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