CRISPR核酸檢測新應用：MPXV-CRISPR診斷試紙條高度準確且“比任何其他方法更快”

在《The Lancet Microbe》期刊上發表的一項合作研究中，由Peter Doherty感染與免疫研究所(Doherty研究所)和WEHI (Walter and Eliza Hall醫學研究所)領導的科學家團隊介紹了MPXV-CRISPR——一種強大的診斷工具，能夠在臨床樣本中檢測MPXV，具有高度的準確性，并且由于CRISPR技術的力量，其速度比任何其他方法都要快。這是澳大利亞**個基于CRISPR的診斷方法，專門針對MPXV中發現的基因序列。

研究背景解讀

Mpox(以前稱為猴痘)是由猴痘病毒(MPXV)引起的人畜共患疾病。MPXV是一種大的雙鏈DNA病毒(約197 kb)，屬于正痘病毒屬（Orthopoxvirus），“同門兄弟”還包括天花病毒(variola)。自2022年5月初以來，已有110多個國家報告了超過8.5萬例病例。Mpox病例主要報告在男男性行為者中，也有少數婦女和嬰兒病例報告。2022年7月23日世衛組織宣布mpox為國際關注的突發公共衛生事件，2023年5月11日取消，目前大多數國家的病毒傳播仍保持在低水平。mpox的爆炸性出現，和天花疫苗“謝幕”使得年輕一代普遍缺少對此類病毒免疫力的現實，突出表明需要持續保持警惕和監測MPXV，以防止進一步的大規模疫情。

除疫苗接種外，快速發現和分離病例對控制mpox的公共衛生至關重要。傳統檢測技術的“金標準”qPCR對設備（需要變性、退火和延伸步驟），場地（防污染）和人員（操作技術），樣本數量（批量檢測）要求較高；測序的要求和成本之高更不用提，難以滿足“即時現場檢測”要求，不難想象，COVID-19疫情推動了一系列即場檢測(PoCT，point-of-care test，)的開發，其中包括使用CRISPR和CRISPR相關蛋白(Cas)技術。

以基因組編輯能力而聞名的CRISPR技術，亦可用于設計功能強大且高度敏感的診斷工具。

早在2017左右，CRISPR技術的領頭羊——Jennifer Doudna和張鋒先后報告過利用Cas12和Cas13家族具備collateral cleavage能力（或稱為cleavage in trans）成功設計了基于CRISPR的核酸分子檢測方法。簡單來說，Cas-crRNA復合物識別并結合底物后，不僅能切割底物，還能切割游離在環境內的任意底物，這種能力被稱為反式切割（collateral cleavage）。檢測方法的基本策略是利用等溫核酸擴增技術使底物濃度增加，再利用Cas復合物識別并結合底物后的反式切割能力，切割報告分子，使熒光基團游離而被檢測到。等溫核酸擴增技術與CRISPR-Cas介導的靶點識別的聯合具有高靈敏度和特異性，相對簡單便捷（RPA只需37℃）、耗時短、價格低廉，可能是更適合即場檢測的方法，為包括mpox在內的感染性疾病的低復雜性即場檢測提供了機會。

primer-gRNA設計

這項概念驗證研究采用一種基于CRISPR- Cas12的便攜式等溫擴增檢測MPXV的方法。墨爾本大學的研究人員利用從美國國家生物技術信息中心(NCBI)下載的523個MPXV基因組數據庫，來設計重組酶聚合酶擴增(RPA)引物和CRISPR gRNA (CRISPR guide RNA)：首先鑒定了MPXV中高度保守的基因(存在于≥90%的基因組中)，并進行了個體比對，將其用作引物和gRNA設計的靶點；另外再采用基于k-mer的方法來鑒定MPXV獨有的22-mers到24-mers，并將其與TTTV原間隔區相鄰的基序位點作為gRNA結合位點，引物隨后被設計在該區域的兩側。根據計算機模擬結果(靈敏度≥90%，特異度為100%)，共得到22組引物-gRNA組合。隨后使用基于熒光的讀取結果來評估分析靈敏度和特異性，篩選出3個產生最強信號的組。進一步分析顯示最高靈敏度(LOD為1個基因組拷貝/ μL)的引物-gRNA組合經過靈敏度和特異性分析，對523個MPXV基因組的識別能力分析，最終入選。

橫向流試紙條設計

MPXV-CRISPR檢測包括用引物對樣本進行20分鐘/39℃ 等溫擴增，20分鐘/37℃的CRISPR試劑反應，以及5分鐘的橫向流試紙條（lateral flow strip）檢測。

試紙條的設計跟張峰的SHERLOCK v2版的lateral flow strip設計相似，他們采用了兩端連有發光基團FAM和生物素biotin的報告分子。在室溫下將25 μL MPXV-CRISPR檢測試劑加入75 μL HybriDetect檢測緩沖液中。將橫向流試紙條浸入總體積中5分鐘后進行讀數。

帶有抗FITC抗體的金納米顆粒預置于試紙條的樣品上，生物素配體固定于質控線（control line），抗兔抗體固定于檢測線（Test line）。將樣品反應液滴在樣品墊上，報告分子的FAM部分與抗FITC抗體的金納米顆粒結合，并在毛細作用下樣品向前流動，當目標DNA不存在的情況下(陰性檢測)完整的報告分子的生物素部分被質控線的生物素配體俘獲，質控線顯色，檢測線不顯色；而在目標DNA存在的情況下(陽性檢測)Cas復合物結合靶標并切割靶點，連帶發生反式切割將報告分子中的FAM和生物素切開，被切割下來的生物素部分與生物素配體結合，質控線顯色，而被切割下來的FAM部分與抗FITC抗體金納米顆粒結合繼續向前，在檢測線上被抗兔抗體捕獲顯色。

從等溫擴增到CRISPR檢測結果的**運行時間約為45分鐘，使用所選擇的引物gRNA組合進行基于MPXV的重組酶聚合酶擴增和CRISPR-Cas12的檢測，LOD為1拷貝/ μL，對所檢測的病毒病原體具有100%的特異性。使用熒光讀數對185個臨床樣本進行盲法一致性測試，結果靈敏度為100% (95% CI為89.3 - 100)，特異性為99.3% (95% CI為95.7-100)。試紙條在視覺和計算評估方面具有100%的靈敏度(89.3 - 100)和98.6%的特異性(94.7-100)。總體而言，試紙條結果與基于熒光的讀數高度一致(185次測試中有179次，一致性為96.8%)，差異與低病毒載量樣品有關。

作者的話

墨爾本大學的Soo Jen Low博士是Doherty研究所的研究官員，也是該研究的**作者之一，他說基于CRISPR的診斷工具就像超精確的偵探，可以快速找到與特定病原體存在相關的DNA序列。“為了發揮作用，MPXV-CRISPR必須被‘編程’以識別病毒。我們使用523個MPXV基因組的數據庫來精心設計“向導”，以結合我們在病毒DNA上尋找的特定部分。做到這一點對我們的診斷工具的成功至關重要，”“從本質上講，當臨床樣本中存在病毒DNA時，CRISPR系統被引導到目標，隨后發出信號表明病毒的存在。我們的檢測方法可以達到與金標準PCR方法相當的靈敏度和精度水平，但所需時間很短。”

WEHI的研究助理、該論文的共同**作者Matthew O 'Neill解釋說，這項新技術能夠提供診斷的速度是MPXV-CRISPR的突破性特征之一。“目前mpox診斷主要依賴于中心實驗室環境，存在，而MPXV-CRISPR可以在45分鐘內檢測到病毒。”

根據世衛組織診斷檢測應準確、可獲得和負擔得起的標準，該小組正在努力將MPXV-CRISPR改造成一種便攜式設備，有朝一日可以在全國各地的醫療點部署，以便快速現場檢測猴痘病毒。WEHI的高級研究官員、Doherty研究所初級實驗室主任、該論文的共同資深作者Shivani Pasricha博士說，MPXV-CRISPR有可能徹底改變我們管理痘的方式，對公共衛生產生有意義的影響。“通過改善澳大利亞各地(包括資源有限的地方和偏遠地區)獲得快速可靠診斷的機會，這種分散的檢測方法可以加快治療速度，改善患者的預后，同時加快我們管理未來疫情的能力。”

前景

基于CRISPR的試紙條形式核酸檢測具有準確性高，操作方便易于攜帶和保存，對設備和檢測人員無需特殊要求等優點，比較適合小范圍的即場檢測，如果后繼應用中能解決樣品的快速核酸純化和等溫擴增操作、進一步縮短時間，將會是核酸檢測的另一種有效補充和替代，頗有市場前景，值得重視。

本網站所有轉載文章系出于傳遞更多信息之目的，轉載內容不代表本站立場。不希望被轉載的媒體或個人可與我們聯系，我們將立即進行刪除處理。