CRISPR核酸檢測(cè)新應(yīng)用：MPXV-CRISPR診斷試紙條高度準(zhǔn)確且“比任何其他方法更快”

在《The Lancet Microbe》期刊上發(fā)表的一項(xiàng)合作研究中，由Peter Doherty感染與免疫研究所(Doherty研究所)和WEHI (Walter and Eliza Hall醫(yī)學(xué)研究所)領(lǐng)導(dǎo)的科學(xué)家團(tuán)隊(duì)介紹了MPXV-CRISPR——一種強(qiáng)大的診斷工具，能夠在臨床樣本中檢測(cè)MPXV，具有高度的準(zhǔn)確性，并且由于CRISPR技術(shù)的力量，其速度比任何其他方法都要快。這是澳大利亞**個(gè)基于CRISPR的診斷方法，專門(mén)針對(duì)MPXV中發(fā)現(xiàn)的基因序列。

研究背景解讀

Mpox(以前稱為猴痘)是由猴痘病毒(MPXV)引起的人畜共患疾病。MPXV是一種大的雙鏈DNA病毒(約197 kb)，屬于正痘病毒屬（Orthopoxvirus），“同門(mén)兄弟”還包括天花病毒(variola)。自2022年5月初以來(lái)，已有110多個(gè)國(guó)家報(bào)告了超過(guò)8.5萬(wàn)例病例。Mpox病例主要報(bào)告在男男性行為者中，也有少數(shù)婦女和嬰兒病例報(bào)告。2022年7月23日世衛(wèi)組織宣布mpox為國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，2023年5月11日取消，目前大多數(shù)國(guó)家的病毒傳播仍保持在低水平。mpox的爆炸性出現(xiàn)，和天花疫苗“謝幕”使得年輕一代普遍缺少對(duì)此類病毒免疫力的現(xiàn)實(shí)，突出表明需要持續(xù)保持警惕和監(jiān)測(cè)MPXV，以防止進(jìn)一步的大規(guī)模疫情。

除疫苗接種外，快速發(fā)現(xiàn)和分離病例對(duì)控制mpox的公共衛(wèi)生至關(guān)重要。傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”qPCR對(duì)設(shè)備（需要變性、退火和延伸步驟），場(chǎng)地（防污染）和人員（操作技術(shù)），樣本數(shù)量（批量檢測(cè)）要求較高；測(cè)序的要求和成本之高更不用提，難以滿足“即時(shí)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)”要求，不難想象，COVID-19疫情推動(dòng)了一系列即場(chǎng)檢測(cè)(PoCT，point-of-care test，)的開(kāi)發(fā)，其中包括使用CRISPR和CRISPR相關(guān)蛋白(Cas)技術(shù)。

以基因組編輯能力而聞名的CRISPR技術(shù)，亦可用于設(shè)計(jì)功能強(qiáng)大且高度敏感的診斷工具。

早在2017左右，CRISPR技術(shù)的領(lǐng)頭羊——Jennifer Doudna和張鋒先后報(bào)告過(guò)利用Cas12和Cas13家族具備collateral cleavage能力（或稱為cleavage in trans）成功設(shè)計(jì)了基于CRISPR的核酸分子檢測(cè)方法。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，Cas-crRNA復(fù)合物識(shí)別并結(jié)合底物后，不僅能切割底物，還能切割游離在環(huán)境內(nèi)的任意底物，這種能力被稱為反式切割（collateral cleavage）。檢測(cè)方法的基本策略是利用等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)使底物濃度增加，再利用Cas復(fù)合物識(shí)別并結(jié)合底物后的反式切割能力，切割報(bào)告分子，使熒光基團(tuán)游離而被檢測(cè)到。等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)與CRISPR-Cas介導(dǎo)的靶點(diǎn)識(shí)別的聯(lián)合具有高靈敏度和特異性，相對(duì)簡(jiǎn)單便捷（RPA只需37℃）、耗時(shí)短、價(jià)格低廉，可能是更適合即場(chǎng)檢測(cè)的方法，為包括mpox在內(nèi)的感染性疾病的低復(fù)雜性即場(chǎng)檢測(cè)提供了機(jī)會(huì)。

primer-gRNA設(shè)計(jì)

這項(xiàng)概念驗(yàn)證研究采用一種基于CRISPR- Cas12的便攜式等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)MPXV的方法。墨爾本大學(xué)的研究人員利用從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)下載的523個(gè)MPXV基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，來(lái)設(shè)計(jì)重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)引物和CRISPR gRNA (CRISPR guide RNA)：首先鑒定了MPXV中高度保守的基因(存在于≥90%的基因組中)，并進(jìn)行了個(gè)體比對(duì)，將其用作引物和gRNA設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)；另外再采用基于k-mer的方法來(lái)鑒定MPXV獨(dú)有的22-mers到24-mers，并將其與TTTV原間隔區(qū)相鄰的基序位點(diǎn)作為gRNA結(jié)合位點(diǎn)，引物隨后被設(shè)計(jì)在該區(qū)域的兩側(cè)。根據(jù)計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果(靈敏度≥90%，特異度為100%)，共得到22組引物-gRNA組合。隨后使用基于熒光的讀取結(jié)果來(lái)評(píng)估分析靈敏度和特異性，篩選出3個(gè)產(chǎn)生最強(qiáng)信號(hào)的組。進(jìn)一步分析顯示最高靈敏度(LOD為1個(gè)基因組拷貝/ μL)的引物-gRNA組合經(jīng)過(guò)靈敏度和特異性分析，對(duì)523個(gè)MPXV基因組的識(shí)別能力分析，最終入選。

橫向流試紙條設(shè)計(jì)

MPXV-CRISPR檢測(cè)包括用引物對(duì)樣本進(jìn)行20分鐘/39℃ 等溫?cái)U(kuò)增，20分鐘/37℃的CRISPR試劑反應(yīng)，以及5分鐘的橫向流試紙條（lateral flow strip）檢測(cè)。

試紙條的設(shè)計(jì)跟張峰的SHERLOCK v2版的lateral flow strip設(shè)計(jì)相似，他們采用了兩端連有發(fā)光基團(tuán)FAM和生物素biotin的報(bào)告分子。在室溫下將25 μL MPXV-CRISPR檢測(cè)試劑加入75 μL HybriDetect檢測(cè)緩沖液中。將橫向流試紙條浸入總體積中5分鐘后進(jìn)行讀數(shù)。

帶有抗FITC抗體的金納米顆粒預(yù)置于試紙條的樣品上，生物素配體固定于質(zhì)控線（control line），抗兔抗體固定于檢測(cè)線（Test line）。將樣品反應(yīng)液滴在樣品墊上，報(bào)告分子的FAM部分與抗FITC抗體的金納米顆粒結(jié)合，并在毛細(xì)作用下樣品向前流動(dòng)，當(dāng)目標(biāo)DNA不存在的情況下(陰性檢測(cè))完整的報(bào)告分子的生物素部分被質(zhì)控線的生物素配體俘獲，質(zhì)控線顯色，檢測(cè)線不顯色；而在目標(biāo)DNA存在的情況下(陽(yáng)性檢測(cè))Cas復(fù)合物結(jié)合靶標(biāo)并切割靶點(diǎn)，連帶發(fā)生反式切割將報(bào)告分子中的FAM和生物素切開(kāi)，被切割下來(lái)的生物素部分與生物素配體結(jié)合，質(zhì)控線顯色，而被切割下來(lái)的FAM部分與抗FITC抗體金納米顆粒結(jié)合繼續(xù)向前，在檢測(cè)線上被抗兔抗體捕獲顯色。

從等溫?cái)U(kuò)增到CRISPR檢測(cè)結(jié)果的**運(yùn)行時(shí)間約為45分鐘，使用所選擇的引物gRNA組合進(jìn)行基于MPXV的重組酶聚合酶擴(kuò)增和CRISPR-Cas12的檢測(cè)，LOD為1拷貝/ μL，對(duì)所檢測(cè)的病毒病原體具有100%的特異性。使用熒光讀數(shù)對(duì)185個(gè)臨床樣本進(jìn)行盲法一致性測(cè)試，結(jié)果靈敏度為100% (95% CI為89.3 - 100)，特異性為99.3% (95% CI為95.7-100)。試紙條在視覺(jué)和計(jì)算評(píng)估方面具有100%的靈敏度(89.3 - 100)和98.6%的特異性(94.7-100)。總體而言，試紙條結(jié)果與基于熒光的讀數(shù)高度一致(185次測(cè)試中有179次，一致性為96.8%)，差異與低病毒載量樣品有關(guān)。

作者的話

墨爾本大學(xué)的Soo Jen Low博士是Doherty研究所的研究官員，也是該研究的**作者之一，他說(shuō)基于CRISPR的診斷工具就像超精確的偵探，可以快速找到與特定病原體存在相關(guān)的DNA序列。“為了發(fā)揮作用，MPXV-CRISPR必須被‘編程’以識(shí)別病毒。我們使用523個(gè)MPXV基因組的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)精心設(shè)計(jì)“向?qū)?/span>”，以結(jié)合我們?cè)诓《?/span>DNA上尋找的特定部分。做到這一點(diǎn)對(duì)我們的診斷工具的成功至關(guān)重要，”“從本質(zhì)上講，當(dāng)臨床樣本中存在病毒DNA時(shí)，CRISPR系統(tǒng)被引導(dǎo)到目標(biāo)，隨后發(fā)出信號(hào)表明病毒的存在。我們的檢測(cè)方法可以達(dá)到與金標(biāo)準(zhǔn)PCR方法相當(dāng)?shù)撵`敏度和精度水平，但所需時(shí)間很短。”

WEHI的研究助理、該論文的共同**作者Matthew O 'Neill解釋說(shuō)，這項(xiàng)新技術(shù)能夠提供診斷的速度是MPXV-CRISPR的突破性特征之一。“目前mpox診斷主要依賴于中心實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，存在，而MPXV-CRISPR可以在45分鐘內(nèi)檢測(cè)到病毒。”

根據(jù)世衛(wèi)組織診斷檢測(cè)應(yīng)準(zhǔn)確、可獲得和負(fù)擔(dān)得起的標(biāo)準(zhǔn)，該小組正在努力將MPXV-CRISPR改造成一種便攜式設(shè)備，有朝一日可以在全國(guó)各地的醫(yī)療點(diǎn)部署，以便快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)猴痘病毒。WEHI的高級(jí)研究官員、Doherty研究所初級(jí)實(shí)驗(yàn)室主任、該論文的共同資深作者Shivani Pasricha博士說(shuō)，MPXV-CRISPR有可能徹底改變我們管理痘的方式，對(duì)公共衛(wèi)生產(chǎn)生有意義的影響。“通過(guò)改善澳大利亞各地(包括資源有限的地方和偏遠(yuǎn)地區(qū))獲得快速可靠診斷的機(jī)會(huì)，這種分散的檢測(cè)方法可以加快治療速度，改善患者的預(yù)后，同時(shí)加快我們管理未來(lái)疫情的能力。”

前景

基于CRISPR的試紙條形式核酸檢測(cè)具有準(zhǔn)確性高，操作方便易于攜帶和保存，對(duì)設(shè)備和檢測(cè)人員無(wú)需特殊要求等優(yōu)點(diǎn)，比較適合小范圍的即場(chǎng)檢測(cè)，如果后繼應(yīng)用中能解決樣品的快速核酸純化和等溫?cái)U(kuò)增操作、進(jìn)一步縮短時(shí)間，將會(huì)是核酸檢測(cè)的另一種有效補(bǔ)充和替代，頗有市場(chǎng)前景，值得重視。

本網(wǎng)站所有轉(zhuǎn)載文章系出于傳遞更多信息之目的，轉(zhuǎn)載內(nèi)容不代表本站立場(chǎng)。不希望被轉(zhuǎn)載的媒體或個(gè)人可與我們聯(lián)系，我們將立即進(jìn)行刪除處理。