病毒microRNA簇中的順式調(diào)控

　　MicroRNAs(MiRNAs)是一種小的調(diào)控RNA，幾乎參與了所有的生物過(guò)程。雖然它們中的許多是從簇中共表達(dá)的，但關(guān)于這個(gè)組織對(duì)它們積累調(diào)控的影響知之甚少。在這項(xiàng)研究中，作者試圖破譯一種控制卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kshv)10個(gè)聚集的前miRNAs表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。作者在體外測(cè)定了微處理器對(duì)單個(gè)Pre-miRNA的切割效率，發(fā)現(xiàn)Pre-miR-K1和-K3是切割效率最高的Pre-miRNAs。突變分析表明，除了產(chǎn)生成熟的miRNAs外，它們對(duì)整個(gè)miRNAs的優(yōu)化表達(dá)也很重要。作者證明了這一特征依賴于該位置是否存在規(guī)范的PremiRNA，因?yàn)榭梢栽诠δ苌嫌卯愒吹腜remiRNA取代PremiR-K1。進(jìn)一步的體外加工分析表明，兩個(gè)莖環(huán)在順式作用，簇是以順序的方式切割的。最后，作者利用該簇的這一特性，通過(guò)在表達(dá)合成結(jié)構(gòu)或潛伏感染KSHV的細(xì)胞中用基于LNA的反義寡核苷酸靶向Premir-K1來(lái)抑制整個(gè)miRNAs的表達(dá)。

　　卡波西肉瘤皰疹病毒(KSHV)或人類皰疹病毒8型是一種伽瑪皰疹病毒，與卡波西肉瘤、B淋巴瘤或增殖性疾病Castelman病等癌癥有關(guān)。它的基因組是一個(gè)165kb的～dsdna分子，編碼>90個(gè)開(kāi)放閱讀框架(Orf)和25個(gè)成熟的microRNA(MiRNA)。KSHV通過(guò)限制病毒基因的表達(dá)建立終生持續(xù)感染。然而，有一小部分細(xì)胞(<3%)支持裂解復(fù)制，在某些條件下，KSHV可以從潛伏期重新激活到裂解復(fù)制。KSHV復(fù)制潛伏期和裂解期之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于建立成功的病毒感染、維持潛伏期至關(guān)重要，并與腫瘤形成等致病效應(yīng)有關(guān)。

　　有趣的是，所有KSHV前體(前)miRNAs都在同一個(gè)多順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄本上表達(dá)，這與潛伏期有關(guān)。其中10個(gè)基因(前miR-k1到-k9和miR-k11)聚集在～4kb的內(nèi)含子中，位于orf71(v-flip)和kaposin基因之間，并在潛在啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。Premir-K10和Pre-miR-K12分別定位于kaposin基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)和3’非編碼區(qū)(3’UTR)，并受潛伏啟動(dòng)子和裂解啟動(dòng)子的控制。

　　KSHV miRNAs能夠調(diào)節(jié)病毒和細(xì)胞基因的表達(dá)，這些基因?qū)Σ《靖腥竞拖嚓P(guān)疾病至關(guān)重要。在潛伏期大量表達(dá)，它們直接參與病毒的維持，例如直接或間接地通過(guò)靶向NF-kB途徑，復(fù)制和轉(zhuǎn)錄激活因子(Rta)，這是病毒重新激活的關(guān)鍵。它們還通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、血管生成或細(xì)胞周期來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。最后，KSHV miRNAs還通過(guò)調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)免疫逃避和病毒致病作用。

　　盡管目前對(duì)KSHV miRNAs功能的研究十分活躍，但對(duì)這些關(guān)鍵病毒因子的表達(dá)調(diào)控還沒(méi)有一個(gè)準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)。在動(dòng)物體內(nèi)，miRNA的生物發(fā)生是一個(gè)多步驟的過(guò)程，包括RNaseIII酶的兩個(gè)成熟過(guò)程。Mirna基因通常由rna聚合酶ii轉(zhuǎn)錄成幾千個(gè)堿基的長(zhǎng)初級(jí)轉(zhuǎn)錄本(pri-mirna)，它可以含有一個(gè)或幾個(gè)mirna前體發(fā)夾(pre-mirna)。首先，pri-miRNA由微處理器在細(xì)胞核中處理，包括RNaseIII型酶DROSHA及其輔因子Dgcr8。在輸出到細(xì)胞質(zhì)后，前miRNA被另一種與TRBP相關(guān)的RNaseIII酶Disher進(jìn)一步加工。最終的結(jié)果是miRNAs的雙鏈(5p和3p)，其中一條鏈優(yōu)先結(jié)合到Argonaute蛋白中，形成RISC復(fù)合體，然后RISC復(fù)合體可以被定向到靶mRNAs。存在miRNA生物發(fā)生的替代途徑，例如不依賴于DROSHA的Mirtron的處理或依賴于DICER的Ago2依賴的miR-451裂解。

　　微處理器對(duì)KSHV聚簇前mirna體外成熟的動(dòng)力學(xué)分析

　　最后，作者開(kāi)發(fā)了一種基于鎖定核酸(LNA)寡核苷酸的反義策略，在轉(zhuǎn)錄后下調(diào)整個(gè)KSHV miRNA簇的表達(dá)。使用針對(duì)前miR-K1序列5p或3p的LNA，作者成功地顯著降低了轉(zhuǎn)染合成構(gòu)建物的細(xì)胞中聚集的KSHV miRNAs水平。作者還表明，在KSHV感染的細(xì)胞中，當(dāng)LNA靶向Pre-miR-K1時(shí)，來(lái)自簇的新合成miRNAs的水平顯著下降，這表明這可能是一種有用的策略來(lái)阻斷感染細(xì)胞中的整個(gè)簇。