關于支原體qPCR檢測方法學驗證的關鍵點

傳統的支原體檢查方法主要包括培養法和指示細胞培養法，這些方法已被藥典認可和納入。然而，近年來，"支原體qPCR檢測"在工業領域的應用日益增多。在項目申報之前，必須進行方法學驗證，根據藥典的要求，在檢測限、特異性和耐用性等方面達到要求后，才能替代傳統的檢查方法。

本期內容，我們將介紹『支原體qPCR檢測』方法驗證的一般要求。

藥典要求

各國藥典對支原體核酸擴增檢測方法（簡稱NAT法）的驗證要求略有出入，但均要求對最低檢出限、特異性和耐用性進行驗證。在檢測方法上，均要求先做樣本的支原體DNA抽提，再進行支原體檢測。

如使用商品化試劑盒，則除了需要試劑盒生產商提供完整的方法學驗證數據外，還需要使用者驗證試劑盒對其樣本的適用性，以及試劑盒表現出預期的性能（例如檢測限、耐用性、是否存在與細菌的交叉反應）。這些必須由使用者自己來證明。

在最低檢出限驗證中，歐洲藥典（簡稱EP）規定了污染細胞的常見9種支原體，要求NAT如替代培養法，對這9種支原體的檢測限需均達到10CFU/ml。其中如果生產中未采用昆蟲或植物源材料，可不必檢檸檬螺原體（Spiroplasma citri）；如果生產中未使用或暴露于禽源材料，可不必檢關節液支原體（M. synoviae）。

日本藥典（簡稱JP）中的驗證要求與EP基本一致，但在最低檢出限驗證中，JP 17未提及雞敗血支原體，但增加了唾液支原體的驗證。

最終待驗證的支原體物種的選擇，在依據藥典基礎上，還需根據支原體污染風險大小而定。污染風險的影響因素有支原體寄生的宿主細胞的特異性、原材料的來源、產品的應用領域等。

關于檢測限和耐用性的檢測次數，有如下公式可參考：

檢測次數 = 支原體物種數 × 3 輪獨立檢測 × 8個復孔/每個物種/每輪

以歐洲藥典規定的9種支原體為例，實際所需檢測次數為9 × 3 × 8 = 216 次檢測。

加上陰性對照、陽性對照、無模板對照以及特異性驗證，預計規格為250次/盒的試劑盒較為適合。

在NAT法的特異性驗證方面，歐洲藥典EP2.6.7指出，梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關系，應優先選擇進行驗證。

至于更具體的驗證方案，還需要使用者針對自己的產品以及流程自行設計，德國MB公司也可協助完善。

方法學驗證的完成，需要多種試劑盒配合使用才可完成。德國MB公司生產的支原體qPCR檢測相關試劑盒，符合歐洲藥典EP、美國藥典USP、日本藥典JP、中國藥典等各國藥典要求。

支原體DNA抽提試劑盒——Venor?GeM Sample preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒

符合歐洲藥典的要求，從細胞上清和生物制品中，均可分離支原體DNA，全程只需30分鐘。洗脫DNA純度高，體積50μl，保證PCR的靈敏。

支原體qPCR檢測——支原體qPCR檢測試劑盒Venor?Gem qEP

經典法qPCR試劑盒遵循歐洲藥典流程要求，高特異性，一次檢測即可涵蓋了所有可能感染細胞的支原體物種，高靈敏度，可達到≤10CFU/ml。

支原體靈敏度驗證——支原體靈敏度標準品 10 CFU? Mycoplasma Sensitivity Standards

支原體靈敏度標準品（滅活支原體），涵蓋了歐洲藥典和日本藥典規定的所有支原體物種（見下表），用于支原體核酸擴增法（PCR/qPCR）的方法學驗證（檢測限和耐用性驗證）。

支原體特異性驗證——支原體基因組DNA Genomic DNA extracts

用于PCR和qPCR方法對支原體物種的特異性檢查，每種支原體DNA經測序驗證，濃度經滴度測定。

支原體PCR定量標準品——絕對定量標準品Quantification Standards DNA

含有從特定微生物中以低培養傳代數提取的基因組DNA。用標準化的方法分析DNA起始物質，以確定DNA的完整性和數量。最終的DNA提取部分測序，以確認物種的身份。