關(guān)于支原體qPCR檢測(cè)方法學(xué)驗(yàn)證的關(guān)鍵點(diǎn)

傳統(tǒng)的支原體檢查方法主要包括培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法，這些方法已被藥典認(rèn)可和納入。然而，近年來，"支原體qPCR檢測(cè)"在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用日益增多。在項(xiàng)目申報(bào)之前，必須進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，根據(jù)藥典的要求，在檢測(cè)限、特異性和耐用性等方面達(dá)到要求后，才能替代傳統(tǒng)的檢查方法。

本期內(nèi)容，我們將介紹『支原體qPCR檢測(cè)』方法驗(yàn)證的一般要求。

藥典要求

各國(guó)藥典對(duì)支原體核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法（簡(jiǎn)稱NAT法）的驗(yàn)證要求略有出入，但均要求對(duì)最低檢出限、特異性和耐用性進(jìn)行驗(yàn)證。在檢測(cè)方法上，均要求先做樣本的支原體DNA抽提，再進(jìn)行支原體檢測(cè)。

如使用商品化試劑盒，則除了需要試劑盒生產(chǎn)商提供完整的方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù)外，還需要使用者驗(yàn)證試劑盒對(duì)其樣本的適用性，以及試劑盒表現(xiàn)出預(yù)期的性能（例如檢測(cè)限、耐用性、是否存在與細(xì)菌的交叉反應(yīng)）。這些必須由使用者自己來證明。

在最低檢出限驗(yàn)證中，歐洲藥典（簡(jiǎn)稱EP）規(guī)定了污染細(xì)胞的常見9種支原體，要求NAT如替代培養(yǎng)法，對(duì)這9種支原體的檢測(cè)限需均達(dá)到10CFU/ml。其中如果生產(chǎn)中未采用昆蟲或植物源材料，可不必檢檸檬螺原體（Spiroplasma citri）；如果生產(chǎn)中未使用或暴露于禽源材料，可不必檢關(guān)節(jié)液支原體（M. synoviae）。

日本藥典（簡(jiǎn)稱JP）中的驗(yàn)證要求與EP基本一致，但在最低檢出限驗(yàn)證中，JP 17未提及雞敗血支原體，但增加了唾液支原體的驗(yàn)證。

最終待驗(yàn)證的支原體物種的選擇，在依據(jù)藥典基礎(chǔ)上，還需根據(jù)支原體污染風(fēng)險(xiǎn)大小而定。污染風(fēng)險(xiǎn)的影響因素有支原體寄生的宿主細(xì)胞的特異性、原材料的來源、產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域等。

關(guān)于檢測(cè)限和耐用性的檢測(cè)次數(shù)，有如下公式可參考：

檢測(cè)次數(shù) = 支原體物種數(shù) × 3 輪獨(dú)立檢測(cè) × 8個(gè)復(fù)孔/每個(gè)物種/每輪

以歐洲藥典規(guī)定的9種支原體為例，實(shí)際所需檢測(cè)次數(shù)為9 × 3 × 8 = 216 次檢測(cè)。

加上陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、無模板對(duì)照以及特異性驗(yàn)證，預(yù)計(jì)規(guī)格為250次/盒的試劑盒較為適合。

在NAT法的特異性驗(yàn)證方面，歐洲藥典EP2.6.7指出，梭菌、乳酸桿菌和鏈球菌與支原體具有較近親緣關(guān)系，應(yīng)優(yōu)先選擇進(jìn)行驗(yàn)證。

至于更具體的驗(yàn)證方案，還需要使用者針對(duì)自己的產(chǎn)品以及流程自行設(shè)計(jì)，德國(guó)MB公司也可協(xié)助完善。

方法學(xué)驗(yàn)證的完成，需要多種試劑盒配合使用才可完成。德國(guó)MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測(cè)相關(guān)試劑盒，符合歐洲藥典EP、美國(guó)藥典USP、日本藥典JP、中國(guó)藥典等各國(guó)藥典要求。

支原體DNA抽提試劑盒——Venor?GeM Sample preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒

符合歐洲藥典的要求，從細(xì)胞上清和生物制品中，均可分離支原體DNA，全程只需30分鐘。洗脫DNA純度高，體積50μl，保證PCR的靈敏。

支原體qPCR檢測(cè)——支原體qPCR檢測(cè)試劑盒Venor?Gem qEP

經(jīng)典法qPCR試劑盒遵循歐洲藥典流程要求，高特異性，一次檢測(cè)即可涵蓋了所有可能感染細(xì)胞的支原體物種，高靈敏度，可達(dá)到≤10CFU/ml。

支原體靈敏度驗(yàn)證——支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品 10 CFU? Mycoplasma Sensitivity Standards

支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品（滅活支原體），涵蓋了歐洲藥典和日本藥典規(guī)定的所有支原體物種（見下表），用于支原體核酸擴(kuò)增法（PCR/qPCR）的方法學(xué)驗(yàn)證（檢測(cè)限和耐用性驗(yàn)證）。

支原體特異性驗(yàn)證——支原體基因組DNA Genomic DNA extracts

用于PCR和qPCR方法對(duì)支原體物種的特異性檢查，每種支原體DNA經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，濃度經(jīng)滴度測(cè)定。

支原體PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品——絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品Quantification Standards DNA

含有從特定微生物中以低培養(yǎng)傳代數(shù)提取的基因組DNA。用標(biāo)準(zhǔn)化的方法分析DNA起始物質(zhì)，以確定DNA的完整性和數(shù)量。最終的DNA提取部分測(cè)序，以確認(rèn)物種的身份。