PCR 實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性（無擴(kuò)增產(chǎn)物）是什么原因？如何解決？

PCR 實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性（無擴(kuò)增產(chǎn)物）

現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，樣品無條帶

可能原因：

· 模板：含有?Taq 酶抑制劑、雜蛋白，模板上樣量低或模板降解

· 引物：引物降解，引物設(shè)計(jì)不合理

· 試劑：酶失活，buffer 不合適

· 反應(yīng)條件：退火溫度高，延伸時(shí)間短

解決方法：

· 純化模板并重新提取，并檢測(cè)模板是否含有抑制劑

· 重新設(shè)計(jì)引物并低溫保存

· 優(yōu)化 buffer，摸索鎂離子濃度或適當(dāng)加入 DMSO（小于 0.3%）

· 提高退火溫度，增加延伸時(shí)間（反應(yīng)條件參照試劑盒說明書）

PCR 實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陽性

現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)條帶

可能原因：

· 引物設(shè)計(jì)不適，與目的序列具有同源性

· 試劑污染：水、移液槍等被核酸污染

· 樣品間出現(xiàn)交叉污染

解決方法：

· 實(shí)驗(yàn)儀器高壓滅菌

· 實(shí)驗(yàn)試劑（酶除外）高壓滅菌，離心管槍頭一次性使用

· 規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作

· 假陽性可通過巢式 PCR 解決，或者使用特異性較高的試劑盒擴(kuò)增