PCR 實驗中出現假陰性（無擴增產物）是什么原因？如何解決？

PCR 實驗中出現假陰性（無擴增產物）

現象：正對照有條帶，樣品無條帶

可能原因：

· 模板：含有?Taq 酶抑制劑、雜蛋白，模板上樣量低或模板降解

· 引物：引物降解，引物設計不合理

· 試劑：酶失活，buffer 不合適

· 反應條件：退火溫度高，延伸時間短

解決方法：

· 純化模板并重新提取，并檢測模板是否含有抑制劑

· 重新設計引物并低溫保存

· 優化 buffer，摸索鎂離子濃度或適當加入 DMSO（小于 0.3%）

· 提高退火溫度，增加延伸時間（反應條件參照試劑盒說明書）

PCR 實驗中出現假陽性

現象：空白對照出現條帶

可能原因：

· 引物設計不適，與目的序列具有同源性

· 試劑污染：水、移液槍等被核酸污染

· 樣品間出現交叉污染

解決方法：

· 實驗儀器高壓滅菌

· 實驗試劑（酶除外）高壓滅菌，離心管槍頭一次性使用

· 規范實驗操作

· 假陽性可通過巢式 PCR 解決，或者使用特異性較高的試劑盒擴增