新研究揭示Rpd3S/HDAC結(jié)合和催化核小體底物的分子機制

組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDACs)是進化上保守的酶，可以去除組蛋白上的乙?；揎棧⒃诒碛^遺傳基因沉默中發(fā)揮核心作用[1]。HDACs大家族根據(jù)與酵母中序列同源性和結(jié)構(gòu)域組織差異可分為四類，其中I類HDAC被廣泛研究，因為其是多種疾?。ò┌Y、炎癥、感染和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等）的表觀遺傳治療非常有希望的靶點[2]。釀酒酵母中的Rpd3是I類HDAC的創(chuàng)始成員，它在體內(nèi)可以形成兩種不同的復(fù)合物:在啟動子區(qū)域去乙?；M蛋白的~ 1.2 MDa Rpd3L，以及靶向轉(zhuǎn)錄區(qū)域抑制基因轉(zhuǎn)錄起始的~ 0.6 MDa Rpd3S[3,4]。Rpd3S由三個核心蛋白：Rpd3、Sin3和Ume1以及兩個染色質(zhì)結(jié)合亞基：Eaf3和Rco1組成[5,6]。在高等真核生物中，額外的組成亞基以及類似物和異構(gòu)體的存在進一步增加了HDAC復(fù)合物的異質(zhì)性，限制了我們對這些復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能的理解。

2023年10月16日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部王雪娟、蔡剛教授團隊合作在Cell Research（IF=44）期刊上在線發(fā)表了題為Structural basis for nucleosome binding and catalysis by the yeast Rpd3S/HDAC holoenzyme的研究論文。該研究利用冷凍電鏡技術(shù)解析了Rpd3S/HDAC全酶復(fù)合物結(jié)合H3K36me3修飾核小體底物復(fù)合物的高分辨結(jié)構(gòu)，**清晰捕獲了結(jié)合在Rpd3S/HDAC活性中心的天然催化底物--組蛋白H3尾部（1-24氨基酸殘基），并意外地發(fā)現(xiàn)了H3K18殘基的側(cè)鏈對準HDAC催化殘基等待催化；并通過功能手段進一步驗證了結(jié)構(gòu)上的發(fā)現(xiàn)，尤其是Rco1亞基N端結(jié)構(gòu)域在核小體底物結(jié)合和活性精準調(diào)控中起到的關(guān)鍵作用。

早在2005年Jerry Workman團隊已經(jīng)清晰鑒定了Rpd3S復(fù)合物的5種亞基組成[3]，但是由于其整體蛋白分子結(jié)構(gòu)柔性較大，為其高分辨結(jié)構(gòu)的解析帶來了很大的難度。酵母Rpd3S復(fù)合物相關(guān)結(jié)構(gòu)及其人類同源物Sin3B復(fù)合物的結(jié)構(gòu)直到近期才被報道[7-9]。然而，Rpd3S如何識別和催化底物，及其HDAC活性精細調(diào)控的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機制尚不清楚。

為了回答這個重要的科學(xué)問題，該研究團隊首先通過大規(guī)模培養(yǎng)酵母細胞和內(nèi)源性蛋白純化獲得了高度均一的Rpd3S復(fù)合物蛋白，優(yōu)化并組裝了**單核小體底物（H3K36me3修飾；僅在核小體一端伸出70bp linker DNA）。在不引入任何化學(xué)交聯(lián)劑干擾的情況下，成功體外組裝了Rpd3S-核小體復(fù)合物，解析了3.7 ?分辨率的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。

該結(jié)構(gòu)揭示了Rpd3S包含兩個Rco1和兩個Eaf3拷貝，它們通過Rco1 C-端卷曲區(qū)域（CC）進行二聚化，Eaf3 CHD結(jié)構(gòu)域識別H3K36me3標記并與核小體DNA相互作用。Sin3作為支架蛋白和Rco1亞基一起協(xié)調(diào)了復(fù)合物的組裝，并通過其HID、MD和CTD結(jié)構(gòu)域包裹住催化亞基Rpd3；同時，Sin3-DNA、Rco1-linker DNA結(jié)合界面共同幫助引導(dǎo)Rpd3S精準錨定在核小體底物上。

Rco1 N端的ABR結(jié)構(gòu)域通過R61和K64殘基直接錨定在組蛋白的酸性斑塊的表面，并通過R50和R51殘基在SHL -6.5處與核小體DNA結(jié)合。此外，Rco1 PHD1結(jié)構(gòu)域的D261側(cè)鏈直接與H3K4me0相互作用、參與底物的識別；而Rco1 PHD2結(jié)構(gòu)域與Rpd3相互作用參與復(fù)合物整體結(jié)構(gòu)的組裝和穩(wěn)定。

H3K18Ac是癌癥進展的重要標志，也是抗癌治療的潛在靶點[10]，該結(jié)構(gòu)**解析了完整的天然底物H3尾巴（1-24 aa）結(jié)合在活性中心的結(jié)合狀態(tài)，并且H3K18殘基朝向催化中心。這些結(jié)構(gòu)上的重要發(fā)現(xiàn)，被體外的功能實驗進一步地得到證實。

該研究報道了Rpd3S全酶結(jié)合和催化核小體底物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，清晰揭示了Rpd3S全酶底物識別特異性和催化復(fù)雜性，闡明了Rpd3S通過構(gòu)象變化實現(xiàn)組蛋白多位點催化的機制，為研制高特異性Rpd3S/Sin3B抑制劑用于癌癥治療提供了新的靶點。

這項工作是在中國科學(xué)院戰(zhàn)略先導(dǎo)B專項和國家自然科學(xué)基金項目的資助下完成的；中國科大生醫(yī)部王雪娟教授和蔡剛教授為該論文的共同通訊作者，博士生張躍躍和博士后徐夢雪為該論文的共同**作者，研究生王坡、周佳慧、王光顯和韓帥龍參與了部分工作。數(shù)據(jù)收集在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)冷凍電鏡中心完成。此外，該研究還得到了清華大學(xué)李海濤、陳柱成教授，中國科大臧建業(yè)、施蘊渝教授的大力幫助。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41422-023-00884-2

參考文獻

1. Goldberg, A. D., Allis, C. D. & Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell 128, 635-638 (2007).

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10. Halasa, M. et al. H3K18Ac as a Marker of Cancer Progression and Potential Target of Anti-Cancer Therapy. Cells 8 (2019).