Lon蛋白酶的“5+1”組裝-激活機制

Lon蛋白酶是一種高度保守的AAA+蛋白酶，存在于細菌、古菌和真核細胞器中。它在蛋白質降解、蛋白質質量控制、粒線體基因表達、應激響應以及其他細胞事件中都扮演著重要的角色。研究表明Lon與致病細菌毒力和腫瘤發生發展密切相關，已成為近年來抗菌和抗癌策略的新靶標。

Lon的單體具有3個結構域（N端結構域、AAA+域和蛋白酶域），它通過形成同源六聚體行駛功能。Lon的蛋白水解活性位點位于六聚體的中空腔室中，底物只能通過狹窄的軸向孔進入。張凱銘/李珊珊團隊近年來一直致力于Lon蛋白酶的結構和功能研究，闡明了其N端結構域如何識別底物并使底物去折疊（Sci Adv. 2021a）、ATP酶結構域如何促使底物易位將其送入桶狀降解室（J Biol Chem. 2021）、底物在降解室里如何被水解并作為肽產物釋放（Sci Adv. 2021b）。然而， Lon功能性六聚體的組裝過程仍然未知。

2023年11月13日，中國科學技術大學張凱銘/李珊珊團隊和臺北中央研究院張崇毅團隊合作在Nature communications雜志發表題為“A 5+1 assemble-to-activate mechanism of the Lon proteolytic machine”的文章。這項新的研究展示了Lon AAA+蛋白酶的激活過程，包括五聚體組裝和依賴底物的第六個單體插入形成激活態。

在本次工作中，中科大副研究員李珊珊等人解析了一系列從無底物狀態到底物結合狀態的Lon結構，這些結構使得研究人員能夠識別和觀察不同的組裝中間體中每個單體的結構變化。研究揭示了Lon蛋白酶的螺旋性五聚體的重要作用：在沒有底物的情況下，第六個單體會結合到螺旋五聚體的最低位置，形成具有受阻孔環的自抑制螺旋六聚體。然而，當底物存在時，第6個單體的結合會形成閉合環六聚體，這反過來又打開了蛋白水解槽。因此，在Lon蛋白酶的組裝過程中，五聚體與第6個單體底物依賴性的結合，激活了眾所周知的底物-孔環接觸的形成，最終形成了功能性六聚體。

為了驗證這一“5+1”激活模型，研究人員構建了Lon的單體突變體（?N-E613K和?N-L708R），這些單體突變體可以與五聚體形式結合形成螺旋性六聚體而無法形成功能性六聚體，以濃度依賴的方式完全抑制野生型Lon對底物的降解。這些結果表明，螺旋五聚體，而不是螺旋六聚體，是介導Lon底物依賴性激活的關鍵介質。進一步的研究表明，這些突變體在大腸桿菌細胞中的表達，導致了與Lon缺乏相關的特定表型變化，包括抑制持久性細胞的形成。因此，通過一系列體外和體內實驗，研究人員證明了這種“5+1” 組裝-激活機制的功能和生物學意義。

綜上，這些研究發現為AAA+蛋白酶的激活機制提供了一個新的范例，該激活機制是由底物控制的組裝過程誘導的，其中五聚體的中間狀態在組裝過程中起著至關重要的作用。這項研究強調了細胞內蛋白水解機器是如何受到底物存在的嚴格控制的，如果不受控制，它將具有潛在的破壞性。最后，這項工作還展示了一種抑制細胞內特定AAA+蛋白的新策略，從而阻礙大腸桿菌持久性細胞的形成。這些結果可能為靶向抑制細胞中特定 AAA+ 蛋白的治療應用開辟新途徑。

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