研究揭示人源鈉鈣交換蛋白NCX1的別構抑制的分子機制

近期，中國科學院生物物理研究所趙巖研究組在《EMBO Journal》雜志在線發表題為"Structural insight into the allosteric inhibition of human sodium-calcium exchanger NCX1 by XIP andSEA0400"的研究論文。這項研究通過冷凍電鏡單顆粒技術重構出人源NCX1.3結合特異性抑制劑SEA0400的高分辨結構，揭示了XIP介導的自抑制機制和SEA0400的別構抑制機制。

　鈉鈣交換蛋白（sodium-calcium exchange, NCX）屬于SLC（Solute Carrier）家族和CaCA（Calcium/Cation Antiporter）超家族，是一種雙向離子轉運體，可以通過正向和反向轉運方式，介導細胞內外Na離子和Ca²⁺的交換，對于維持細胞內鈣穩態發揮重要作用。NCX參與體內多種生理過程，例如心肌興奮-收縮耦聯，血壓調節、大腦長時程增強和神經遞質分泌等。在多種心腦血管疾病中存在NCX功能異常，如缺血再灌注損傷、腦卒中、新生兒缺血缺氧性腦病等。因此，NCX結構的研究對于深入了解細胞內鈣離子平衡調節機制、設計新型藥物治療策略以及探索與心血管疾病、神經系統疾病等相關的疾病機制具有關鍵意義。SEA0400是NCX1的選擇性抑制劑并且更傾向抑制NCX的逆轉運模式，該模式負責攝取細胞外Ca²⁺。然而，它對逆向轉運模式而非正向轉運模式選擇性的分子基礎仍然未知。理解這種分子基礎對于合理開發特異性靶向NCX1逆模式的藥理抑制劑至關重要，這在預防缺血/再灌注損傷和心力衰竭背景下的Ca²⁺超載和電功能障礙方面具有很大的治療潛力。

通過冷凍電鏡單顆粒技術解析的野生型NCX1.3的高分辨結構展示了其多個結構域的組裝方式，包括兩個調控性鈣離子結合結構域（CBD1和CBD2）與離子轉運跨膜結構域（TMD）。其中CBD1深入胞漿，而CBD2位于細胞質膜表面附近。CBD1和CBD2形成首尾串聯結構，并形成約126°的夾角。TMD通過一個短螺旋與CBD2相連，位于跨膜螺旋中部的離子結合位點暴露向細胞內側，因此可以判斷出當前解析的結構為內開構象。

在CBD2和TMD之間的凹槽中觀察到了交換抑制肽（the exchanger inhibitory peptide，XIP）的密度。之前的功能研究表明，XIP可以抑制NCX的活性并導致其失活，但其具體抑制機制一直不清楚。進一步的結構分析顯示，XIP通過阻止門控螺旋TMs1/6的構象變化，將NCX穩定在內向構象并阻止其轉變為外向構象，從而抑制NCX的轉運活性。在結構中觀察到了與XIP結合相關的關鍵相互作用，通過點突變及全細胞電生理實驗，發現破壞這些相互作用會使XIP介導的失活被減弱。

細胞質Ca²⁺不僅作為NCX的底物，還通過與細胞內結構域CBD1和CBD2的結合來調節NCX的活性。CBD1含有四個Ca²⁺結合位點。CBD2中Ca²⁺結合位點的數量由其互斥的外顯子A和B決定。含有外顯子A的CBD2有兩個Ca²⁺結合位點，而含有外顯子B的CBD2缺乏Ca²⁺結合位點。NCX1.3含有外顯子B，盡管NCX1.3的CBD2無法與Ca²⁺結合，結構分析顯示CBD2與外顯子A的潛在Ca²⁺結合位點緊鄰XIP結合位點。在NCX1.3的結構中，CBD2表現出負電荷的靜電表面，這有助于與帶正電的XIP區域結合。而Ca²⁺與含外顯子A的CBD2結合將中和這種負電勢，從而減少XIP區域的結合親和力，進而可能導致XIP介導的失活減少甚至完全消除，這是胞內Ca²⁺調控的機制。

選擇性抑制劑SEA0400主要阻斷NCX1，對NCX3幾乎沒有影響。在解析的結構中，它結合到TM2ab周圍的一個變構結合位點，該位點大多數殘基是保守的，除了一個苯丙氨酸在NCX3中被亮氨酸取代，功能實驗進一步證實了這個殘基在亞型選擇性中的關鍵作用，為合理設計亞型特異性藥物提供了堅實的基礎。TM2ab與底物離子的結合和轉運相關，SEA0400通過抑制TM2ab的構象轉變來發揮抑制作用。此外，XIP與TM1-2 loop之間的相互作用也維持了TM2ab的特定構象，這對SEA0400的變構結合至關重要。鈣成像功能實驗也顯示，XIP對于NCX對SEA0400的敏感性至關重要。進一步結構分析發現在逆向轉運模式下，高濃度的細胞內Na⁺促進了XIP與TMD和CBD2的相互作用，導致NCX1.3的失活，而這一過程還穩定了SEA0400的變構結合口袋。這些發現揭示了XIP和SEA0400協同抑制NCX1.3，以及SEA0400在逆向轉運模式下選擇性地靶向NCX1.3的分子基礎。

中國科學院生物物理所研究所趙巖研究員為本文通訊作者，中國科學院生物物理研究所特別研究助理董艷麗、博士研究生于卓亞和博士研究生李悅為論文共同**作者，此外，北京望石智慧黃博，趙巖組白秦儒、高逸偉、陳琦浩、何玲莉，首都醫科大學附屬北京朝陽醫院李娜也為本研究提供了幫助。清華大學的肖百龍課題組提供了鈣成像實驗的指導。冷凍電鏡數據和鈣成像實驗數據收集得到中國科學院生物物理研究所蛋白質科學研究平臺生物成像中心的技術支持。本研究得到科技創新2030"腦科學與類腦研究"重大項目、中國科學院戰略性先導科技專項（B類）、國家自然科學基金項目、國家重點研發計劃項目、中國博士后科學基金、中國科學院青年創新促進會等項目的資助。

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