新方法，一種鑒定同源長非編碼RNA的新方法

長非編碼RNA（lncRNA）的發現和表征是過去幾十年分子生物學領域的重大進展。已有研究成果表明，lncRNA在發育、腫瘤等多種生理和疾病過程中發揮調控作用1-3，但目前絕大多數lncRNA 的功能仍然未知。通過鑒定不同物種間同源的lncRNA，可以篩選出在進化過程中保守的lncRNA，這些lncRNA也更可能具備重要的功能。但是，由于lncRNA的序列保守性較低4,5，傳統的序列比對方式只能鑒定出極少的不同物種間同源的lncRNA。例如，在斑馬魚和人類上萬的lncRNA基因中，通過序列比對只能找到幾十個序列保守的同源lncRNA。因此，不管是從lncRNA的理論還是技術方面考慮，目前都亟需一種新的方法來鑒定不同物種之間的同源lncRNA。

2024年1月9日，清華大學張強鋒、北京大學汪陽明、席建忠研究團隊合作在《自然×遺傳》（Nature genetics）雜志上發表題為“計算預測和實驗驗證鑒定人類和斑馬魚之間功能保守的長非編碼RNA”（Computational prediction and experimental validation identify functionally conserved lncRNAs from zebrafish to human）的研究論文。該工作開發了一套新的計算流程，在包括人類、小鼠、斑馬魚在內的8種脊椎動物中，鑒定保守的同源lncRNA，工作同時開發了基于CRISPR的基因敲除和回補篩選系統，通過實驗驗證了所鑒定的同源lncRNA在不同物種中的保守功能，為該領域的研究提供了新的思路。

該團隊開發了一套鑒定不同物種之間同源lncRNA的計算方法（lncHOME）。lncHOME計算方法通過比較基因組和機器學習的人工智能方法，在8種脊椎動物中鑒定出了一類在不同物種中具有保守基因組位置及保守RNA結合蛋白（RBP）結合位點模式的lncRNA（圖1）。這些不同物種中潛在同源的lncRNA被命名為coPARSE-lncRNA （lncRNA with conserved genomic locations and patterns of RNA binding protein (RBP) binding sites）。

lncHOME計算方法鑒定了570個在斑馬魚中具有同源基因的人類coPARSE-lncRNA，其中通過序列比對的方式僅僅只能鑒定出17個序列保守的同源lncRNA。相比于非同源的lncRNA，這些coPARSE-lncRNA基因富集了更多疾病相關突變，并且更傾向于在癌癥組織中異常表達。這些發現說明coPARSE-lncRNA可能具有重要的生理功能。

接下來，該團隊深入探究了所鑒定的同源lncRNA的功能保守性。首先，通過建立CRISPR-Cas12a介導的大片段基因敲除篩選系統，該團隊鑒定出了75個能促進癌癥細胞增殖的coPARSE-lncRNA，其中37個在HeLa細胞中起重要作用。著該團隊進一步開發了一個基于CRISPR-Cas12a的敲除和回補單步系統，應用該系統發現，通過回補預測的斑馬魚同源lncRNA片段，可以挽救其中4個人類coPARSE-lncRNA的敲除所導致的HeLa細胞增殖的缺陷。更有意思的是，在斑馬魚胚胎中敲低這四個斑馬魚的coPARSE-lncRNA會導致嚴重的胚胎發育延遲，而這些表型可以通過回補人類的同源lncRNA進行挽救。以上結果說明這些同源lncRNA具有很強的功能保守性。

lncHOME算法得到的同源lncRNA具有保守的RBP結合位點模式。根據這一條件推測，coPARSE-lncRNA具有相似的RBP結合圖譜。針對其中兩條coPARSE-lncRNA，該團隊通過RNA沉降結合質譜實驗驗證了這一假設。更重要的是，對于上面所描述的可以挽救細胞增殖或胚胎發育缺陷的同源lncRNA片段，如果突變其中某些RBP（例如NONO和IGF2BP2）的結合位點，所得到的新的片段無法起到挽救效果。這些突變實驗證明了RBP結合位點對coPARSE-lncRNA的功能的重要性。

總而言之，該團隊的研究提供了一個基于機器學習的計算分析方法，鑒定得到了一系列在脊椎動物中潛在同源的lncRNA，并通過實驗驗證了同源lncRNA的功能保守性。這些lncRNA在進化過程中序列保守性逐漸消失，但是卻保留著保守的RBP結合模式（圖2）。該工作極大地擴展了當前脊椎動物中保守的lncRNA庫，為研究lncRNA的進化、功能及作用機制提供了新視角和新資源。

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