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新研究揭示，配體效能調控μ型阿片受體構象動態變化的分子機制

配體效能調控μ型阿片受體構象動態變化的分子機制

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發表時間：2024-04-28 16:37

在臨床治療領域，阿片類藥物，如嗎啡和芬太尼，是目前臨床上最常用的強效鎮痛藥，它們通過激活腦內的μ型阿片受體（μOR）產生鎮痛效果。阿片類藥物的使用歷史悠久，鴉片的使用可追溯到5000多年前的古代蘇美爾文明，而使用提純的嗎啡已有200多年的歷史。然而，阿片類藥物的長期使用可能導致依賴性、耐受性增加以及嚴重的副作用，如便秘和致死的呼吸抑制。2000年以來，阿片類藥物過量使用已經造成約40萬人死亡。正在發生的阿片危機在2018年造成了約7千億美元的經濟損失，約占美國GDP的3.4%。因此，解析μOR的激活機制及其與不同藥物的相互作用對開發新型鎮痛藥物具有重要的理論和實際意義。

2024年4月10日，清華大學生命科學學院陳春來課題組與斯坦福大學 Brian Kobilka課題組、加州大學洛杉磯分校 Wayne Hubbell 課題組以及圣路易斯華盛頓大學車濤課題組合作，在《自然》（Nature）雜志發表了題目為“配體效能調控μ型阿片受體的構象動態（Ligand efficacy modulates conformational dynamics of the μ-opioid receptor）”的研究論文。通過采用先進的雙電子-電子共振（DEER）和單分子熒光共振能量轉移（smFRET）技術，科研團隊揭示了μOR在不同配體和胞內下游信號蛋白作用下的重要亞穩態構象和構象之間的動態變化。研究發現，配體通過調節μOR在不同亞穩態構象之間的動態平衡，進而影響受體對細胞內信號分子的激活能力，即內在效能。

μOR屬于G蛋白偶聯受體（GPCR）家族，這是一類廣泛存在于細胞表面，通過接收外部信號并啟動細胞內響應的膜蛋白。GPCR家族的成員參與了多種生命過程，從視覺和嗅覺到神經傳遞和細胞內信號轉導，因而成為了眾多藥物開發的靶點。從Kobilka 課題組2007年發表**個非視紫紅質的GPCR（β2AR）結構以及2011年發表**個GPCR-G蛋白復合物結構至今，不斷涌現的GPCR與配體以及胞內信號蛋白的高分辨率結構極大增強了我們對GPCR結構和功能的理解。作為一類復雜的、高度動態的別構調控膜蛋白，GPCR在配體作用下可在不同構象之間變化，進而激活下游的G蛋白或者招募β-arrestin（圖一）。然而，X射線晶體學和冷凍電鏡（Cryo-EM）等結構生物學方法只能捕獲GPCR最穩定的構象。那些可能決定了GPCR功能的中間態構象或者低比例的構象卻難以被捕捉。相比之下，DEER技術能在亞埃級分辨率下獲得蛋白的不同構象及其比例，而smFRET技術能夠實時地獲得蛋白構象動態變化的信息。因此，這兩項技術在空間解析和時間解析方面相互補充，有效地揭示了μOR與配體相互作用以及激活下游信號蛋白的分子機制。

本研究中，研究人員首先使用一種新型的硝基氧自由基標記物來標記 μOR 的第四和第六跨膜螺旋（TM4和TM6）的胞內端。通過DEER技術，研究人員獲得了μOR 在嗎啡等九種不同配體以及胞內信號蛋白G蛋白或者β-arrestin 存在時的構象分布（圖二）。結果顯示，μOR存在4種不同的構象，其中兩種構象為抑制狀態（命名為R1和R2），兩種構象為激活狀態（R3和R4）。然而，以往的晶體學和冷凍電鏡研究只揭示了一種抑制狀態和一種激活狀態的構象。通過對比不同條件下μOR的構象分布，研究人員發現，與低效能（low efficacy）配體（如TRV130）相比，高效能（high efficacy）的配體（如lofentanil）在沒有下游G蛋白結合時，就能夠明顯增加μOR在激活狀態的比例。但是當有G蛋白存在時，不同效能的配體均能穩定μOR的R3和R4激活狀態構象，以R3構象為主。這表明配體的效能與其單獨存在時穩定激活狀態構象的能力相關。與G蛋白相比，β-arrestin結合μOR的能力較差，且主要結合μOR的R4構象，這一方面說明μOR可能以不同的構象結合G蛋白和β-arrestin，另一方面展示了高效能的配體能更強地招募β-arrestin的原因是其能夠增加R4狀態的比例。

那么不同效能的配體如何通過調控μOR的構象變化來影響下游G蛋白信號的呢？研究人員使用熒光分子標記μOR的TM4和TM6，并且使用smFRET技術觀測μOR在不同配體和G蛋白、GDP存在時的構象分布及變化速率（圖三和圖四）。與DEER的結果相一致，smFRET實驗結果顯示，μOR在低效能配體存在時更傾向于抑制狀態，而在高效能配體存在時更傾向于激活狀態。當研究者標記μOR的第二個胞內環圈（ICL2）而不是TM4時，smFRET觀測到了拮抗劑或者低效能配體結合的μOR存在兩個狀態，其構象變化可能與配體的低效能相關。研究人員進一步實時觀測了在有G蛋白和不同濃度GDP存在時μOR在激活狀態和抑制狀態之間的變化（圖四）。數據分析顯示，結合G蛋白時，μOR存在兩個激活狀態，分別對應了兩種G蛋白的狀態：結合GDP的G蛋白（EFRET=0.6）和不結合GDP的G蛋白（EFRET=0.5）。與低效能的配體相比，高效能配體增加了結合不含GDP的G蛋白的μOR比例，即更容易使G蛋白的GDP釋放從而結合GTP，進而激活G蛋白。此外，高效能配體能促使μOR快速地結合G蛋白，并且增加G蛋白結合的穩定性從而增加GTP結合的概率。