新研究揭示，配體效能調(diào)控μ型阿片受體構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化的分子機(jī)制

在臨床治療領(lǐng)域，阿片類藥物，如嗎啡和芬太尼，是目前臨床上最常用的強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥，它們通過激活腦內(nèi)的μ型阿片受體（μOR）產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效果。阿片類藥物的使用歷史悠久，鴉片的使用可追溯到5000多年前的古代蘇美爾文明，而使用提純的嗎啡已有200多年的歷史。然而，阿片類藥物的長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致依賴性、耐受性增加以及嚴(yán)重的副作用，如便秘和致死的呼吸抑制。2000年以來，阿片類藥物過量使用已經(jīng)造成約40萬人死亡。正在發(fā)生的阿片危機(jī)在2018年造成了約7千億美元的經(jīng)濟(jì)損失，約占美國(guó)GDP的3.4%。因此，解析μOR的激活機(jī)制及其與不同藥物的相互作用對(duì)開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥物具有重要的理論和實(shí)際意義。

2024年4月10日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳春來課題組與斯坦福大學(xué) Brian Kobilka課題組、加州大學(xué)洛杉磯分校 Wayne Hubbell 課題組以及圣路易斯華盛頓大學(xué)車濤課題組合作，在《自然》（Nature）雜志發(fā)表了題目為“配體效能調(diào)控μ型阿片受體的構(gòu)象動(dòng)態(tài)（Ligand efficacy modulates conformational dynamics of the μ-opioid receptor）”的研究論文。通過采用先進(jìn)的雙電子-電子共振（DEER）和單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移（smFRET）技術(shù)，科研團(tuán)隊(duì)揭示了μOR在不同配體和胞內(nèi)下游信號(hào)蛋白作用下的重要亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象和構(gòu)象之間的動(dòng)態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn)，配體通過調(diào)節(jié)μOR在不同亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象之間的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而影響受體對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的激活能力，即內(nèi)在效能。

μOR屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族，這是一類廣泛存在于細(xì)胞表面，通過接收外部信號(hào)并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)響應(yīng)的膜蛋白。GPCR家族的成員參與了多種生命過程，從視覺和嗅覺到神經(jīng)傳遞和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因而成為了眾多藥物開發(fā)的靶點(diǎn)。從Kobilka 課題組2007年發(fā)表**個(gè)非視紫紅質(zhì)的GPCR（β2AR）結(jié)構(gòu)以及2011年發(fā)表**個(gè)GPCR-G蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)至今，不斷涌現(xiàn)的GPCR與配體以及胞內(nèi)信號(hào)蛋白的高分辨率結(jié)構(gòu)極大增強(qiáng)了我們對(duì)GPCR結(jié)構(gòu)和功能的理解。作為一類復(fù)雜的、高度動(dòng)態(tài)的別構(gòu)調(diào)控膜蛋白，GPCR在配體作用下可在不同構(gòu)象之間變化，進(jìn)而激活下游的G蛋白或者招募β-arrestin（圖一）。然而，X射線晶體學(xué)和冷凍電鏡（Cryo-EM）等結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法只能捕獲GPCR最穩(wěn)定的構(gòu)象。那些可能決定了GPCR功能的中間態(tài)構(gòu)象或者低比例的構(gòu)象卻難以被捕捉。相比之下，DEER技術(shù)能在亞埃級(jí)分辨率下獲得蛋白的不同構(gòu)象及其比例，而smFRET技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)地獲得蛋白構(gòu)象動(dòng)態(tài)變化的信息。因此，這兩項(xiàng)技術(shù)在空間解析和時(shí)間解析方面相互補(bǔ)充，有效地揭示了μOR與配體相互作用以及激活下游信號(hào)蛋白的分子機(jī)制。

本研究中，研究人員首先使用一種新型的硝基氧自由基標(biāo)記物來標(biāo)記 μOR 的第四和第六跨膜螺旋（TM4和TM6）的胞內(nèi)端。通過DEER技術(shù)，研究人員獲得了μOR 在嗎啡等九種不同配體以及胞內(nèi)信號(hào)蛋白G蛋白或者β-arrestin 存在時(shí)的構(gòu)象分布（圖二）。結(jié)果顯示，μOR存在4種不同的構(gòu)象，其中兩種構(gòu)象為抑制狀態(tài)（命名為R1和R2），兩種構(gòu)象為激活狀態(tài)（R3和R4）。然而，以往的晶體學(xué)和冷凍電鏡研究只揭示了一種抑制狀態(tài)和一種激活狀態(tài)的構(gòu)象。通過對(duì)比不同條件下μOR的構(gòu)象分布，研究人員發(fā)現(xiàn)，與低效能（low efficacy）配體（如TRV130）相比，高效能（high efficacy）的配體（如lofentanil）在沒有下游G蛋白結(jié)合時(shí)，就能夠明顯增加μOR在激活狀態(tài)的比例。但是當(dāng)有G蛋白存在時(shí)，不同效能的配體均能穩(wěn)定μOR的R3和R4激活狀態(tài)構(gòu)象，以R3構(gòu)象為主。這表明配體的效能與其單獨(dú)存在時(shí)穩(wěn)定激活狀態(tài)構(gòu)象的能力相關(guān)。與G蛋白相比，β-arrestin結(jié)合μOR的能力較差，且主要結(jié)合μOR的R4構(gòu)象，這一方面說明μOR可能以不同的構(gòu)象結(jié)合G蛋白和β-arrestin，另一方面展示了高效能的配體能更強(qiáng)地招募β-arrestin的原因是其能夠增加R4狀態(tài)的比例。

那么不同效能的配體如何通過調(diào)控μOR的構(gòu)象變化來影響下游G蛋白信號(hào)的呢？研究人員使用熒光分子標(biāo)記μOR的TM4和TM6，并且使用smFRET技術(shù)觀測(cè)μOR在不同配體和G蛋白、GDP存在時(shí)的構(gòu)象分布及變化速率（圖三和圖四）。與DEER的結(jié)果相一致，smFRET實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，μOR在低效能配體存在時(shí)更傾向于抑制狀態(tài)，而在高效能配體存在時(shí)更傾向于激活狀態(tài)。當(dāng)研究者標(biāo)記μOR的第二個(gè)胞內(nèi)環(huán)圈（ICL2）而不是TM4時(shí)，smFRET觀測(cè)到了拮抗劑或者低效能配體結(jié)合的μOR存在兩個(gè)狀態(tài)，其構(gòu)象變化可能與配體的低效能相關(guān)。研究人員進(jìn)一步實(shí)時(shí)觀測(cè)了在有G蛋白和不同濃度GDP存在時(shí)μOR在激活狀態(tài)和抑制狀態(tài)之間的變化（圖四）。數(shù)據(jù)分析顯示，結(jié)合G蛋白時(shí)，μOR存在兩個(gè)激活狀態(tài)，分別對(duì)應(yīng)了兩種G蛋白的狀態(tài)：結(jié)合GDP的G蛋白（EFRET=0.6）和不結(jié)合GDP的G蛋白（EFRET=0.5）。與低效能的配體相比，高效能配體增加了結(jié)合不含GDP的G蛋白的μOR比例，即更容易使G蛋白的GDP釋放從而結(jié)合GTP，進(jìn)而激活G蛋白。此外，高效能配體能促使μOR快速地結(jié)合G蛋白，并且增加G蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性從而增加GTP結(jié)合的概率。

總的來說，這項(xiàng)研究不僅提高了我們對(duì)μOR激活機(jī)制的理解，也為開發(fā)新型的、副作用更小的鎮(zhèn)痛藥物提供了理論基礎(chǔ)。隨著對(duì)GPCR動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系的進(jìn)一步探索，未來有望開發(fā)出更為安全有效的治療方案，以更好地應(yīng)對(duì)疼痛和其他相關(guān)疾病。

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