細胞培養支原體污染,細胞成團怎么辦

當細胞培養中出現支原體污染，并且細胞成團時，需要采取一系列措施來處理這一問題。以下是一些建議的步驟：

一、確認污染并評估情況

確認污染：通過顯微鏡觀察、PCR檢測或其他支原體檢測方法確認細胞確實已被支原體污染。

評估細胞價值：判斷被污染的細胞是否珍貴、樣品是否可再得，以及是否值得進行挽救處理。

二、處理污染細胞

1. 丟棄并重新復蘇

適用情況：對于易于重新獲得的細胞株，或者污染嚴重的細胞，建議直接處理培養物，丟棄所有被污染的細胞和耗材。

操作步驟：

終止試驗，丟棄所有被污染的細胞和耗材。

重新復蘇細胞，注意選用未被污染的細胞株、血清和培養基，并規范操作。

2. 挽救處理

適用情況：對于珍貴的、樣品不可再得的細胞，或價格昂貴的種子細胞，需要進行挽救處理。

操作步驟：

洗滌細胞：使用D-PBSA（稀釋的磷酸鹽緩沖液）洗滌細胞，以減少污染物數量。對于單層細胞，用D-PBSA浸洗培養物3次，胰蛋白酶消化，通過離心重懸用D-PBSA再洗細胞2次；對于懸浮細胞，用D-PBSA離心重懸洗滌細胞。

高種植密度接種：以高種植密度接種1個或多個新培養瓶，以減少支原體污染的機會。

使用抗生素：加入高濃度抗生素培養基，每2天換液。如果不同類型的抗生素與BM-Cyclin交替使用，細胞應在應用新抗生素前換液。注意，過度使用抗生素可能產生更強抗性的菌株，撤藥后極易復發，因此需謹慎使用。

長期無抗生素培養：去掉抗生素后，在無抗生素培養細胞的狀況下培養細胞至少2周，然后再次進行支原體檢測。如果檢測結果仍為陰性，可繼續在無抗生素的條件下培養細胞至少2個月，以確保所有污染已被移除。

三、預防未來污染

嚴格操作規范：加強實驗室的清潔和消毒工作，嚴格遵守無菌操作規范。工作開始時要先用75%酒精消毒手部以及袖口、瓶口等；在進行多種細胞培養操作時，所用器具（如移液槍等）要嚴格區分；在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口，以免把細菌帶到培養液中污染其他細胞。

保證培養基和器材無菌：確保細胞培養基和器材的無菌性。器材一般都經過輻射處理，基本可以保證無菌；商業化CD培養基一般也能保證無菌。如實驗室有發現支原體感染，已經開啟的培養基不宜繼續使用。

定期檢測：定期對實驗室中的培養物進行支原體檢測，以及時發現和處理污染問題。

四、其他注意事項

在處理支原體污染時，應使用孔徑為0.1微米或更小孔的膜的過濾培養基和緩沖液，因為孔徑為0.22或0.45微米的標準培養基過濾裝置無法除去這些小的微生物。

如果支原體污染嚴重且難以清除，可以考慮使用特異性的支原體殺除劑或抑制劑進行處理。但請注意，這些試劑可能價格較高且使用效果因細胞類型和污染程度而異。

綜上所述，處理細胞培養中的支原體污染需要根據具體情況采取合適的措施，并加強預防措施以避免未來再次發生污染。