細胞培養(yǎng)支原體污染,細胞成團怎么辦

當(dāng)細胞培養(yǎng)中出現(xiàn)支原體污染，并且細胞成團時，需要采取一系列措施來處理這一問題。以下是一些建議的步驟：

一、確認污染并評估情況

確認污染：通過顯微鏡觀察、PCR檢測或其他支原體檢測方法確認細胞確實已被支原體污染。

評估細胞價值：判斷被污染的細胞是否珍貴、樣品是否可再得，以及是否值得進行挽救處理。

二、處理污染細胞

1. 丟棄并重新復(fù)蘇

適用情況：對于易于重新獲得的細胞株，或者污染嚴重的細胞，建議直接處理培養(yǎng)物，丟棄所有被污染的細胞和耗材。

操作步驟：

終止試驗，丟棄所有被污染的細胞和耗材。

重新復(fù)蘇細胞，注意選用未被污染的細胞株、血清和培養(yǎng)基，并規(guī)范操作。

2. 挽救處理

適用情況：對于珍貴的、樣品不可再得的細胞，或價格昂貴的種子細胞，需要進行挽救處理。

操作步驟：

洗滌細胞：使用D-PBSA（稀釋的磷酸鹽緩沖液）洗滌細胞，以減少污染物數(shù)量。對于單層細胞，用D-PBSA浸洗培養(yǎng)物3次，胰蛋白酶消化，通過離心重懸用D-PBSA再洗細胞2次；對于懸浮細胞，用D-PBSA離心重懸洗滌細胞。

高種植密度接種：以高種植密度接種1個或多個新培養(yǎng)瓶，以減少支原體污染的機會。

使用抗生素：加入高濃度抗生素培養(yǎng)基，每2天換液。如果不同類型的抗生素與BM-Cyclin交替使用，細胞應(yīng)在應(yīng)用新抗生素前換液。注意，過度使用抗生素可能產(chǎn)生更強抗性的菌株，撤藥后極易復(fù)發(fā)，因此需謹慎使用。

長期無抗生素培養(yǎng)：去掉抗生素后，在無抗生素培養(yǎng)細胞的狀況下培養(yǎng)細胞至少2周，然后再次進行支原體檢測。如果檢測結(jié)果仍為陰性，可繼續(xù)在無抗生素的條件下培養(yǎng)細胞至少2個月，以確保所有污染已被移除。

三、預(yù)防未來污染

嚴格操作規(guī)范：加強實驗室的清潔和消毒工作，嚴格遵守?zé)o菌操作規(guī)范。工作開始時要先用75%酒精消毒手部以及袖口、瓶口等；在進行多種細胞培養(yǎng)操作時，所用器具（如移液槍等）要嚴格區(qū)分；在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細菌帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞。

保證培養(yǎng)基和器材無菌：確保細胞培養(yǎng)基和器材的無菌性。器材一般都經(jīng)過輻射處理，基本可以保證無菌；商業(yè)化CD培養(yǎng)基一般也能保證無菌。如實驗室有發(fā)現(xiàn)支原體感染，已經(jīng)開啟的培養(yǎng)基不宜繼續(xù)使用。

定期檢測：定期對實驗室中的培養(yǎng)物進行支原體檢測，以及時發(fā)現(xiàn)和處理污染問題。

四、其他注意事項

在處理支原體污染時，應(yīng)使用孔徑為0.1微米或更小孔的膜的過濾培養(yǎng)基和緩沖液，因為孔徑為0.22或0.45微米的標準培養(yǎng)基過濾裝置無法除去這些小的微生物。

如果支原體污染嚴重且難以清除，可以考慮使用特異性的支原體殺除劑或抑制劑進行處理。但請注意，這些試劑可能價格較高且使用效果因細胞類型和污染程度而異。

綜上所述，處理細胞培養(yǎng)中的支原體污染需要根據(jù)具體情況采取合適的措施，并加強預(yù)防措施以避免未來再次發(fā)生污染。