qPCR技術(shù)絕對定量與相對定量的區(qū)別

qPCR技術(shù)（實時熒光定量PCR）中的絕對定量與相對定量是兩種不同的定量方法，它們之間存在明顯的區(qū)別。以下是對這兩種定量方法的詳細比較：

一、定義與原理

絕對定量

定義：測定待測樣本中目的基因的準確拷貝數(shù)。

原理：用已知拷貝數(shù)的標準品繪制標準曲線，將待測樣本目的基因的Ct值（循環(huán)閾值，即熒光信號強度達到預設閾值時所經(jīng)歷的擴增循環(huán)數(shù)）帶入標準曲線中，進而獲得樣本中目的基因的準確拷貝數(shù)。

相對定量

定義：通過內(nèi)參基因表征不同樣本中目的基因的倍數(shù)關系，不需要測定樣本中目的基因的準確拷貝數(shù)。

原理：選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為參照，通過比較實驗樣本與對照樣本中靶基因的Ct值差異，得出實驗樣本中靶基因相對于對照樣本的表達量變化倍數(shù)。

二、操作步驟

絕對定量

準備已知濃度的標準品，并確保標準品與待測樣本中的目的基因具有相同的擴增效率。

將標準品稀釋成不同濃度，作為模板進行PCR反應。

以標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以測得的Ct值為縱坐標繪制標準曲線。

對待測樣本進行PCR反應，測定其Ct值，并根據(jù)標準曲線計算待測樣本中目的基因的拷貝數(shù)。

相對定量

選擇合適的內(nèi)參基因，并確保內(nèi)參基因在實驗條件下的表達穩(wěn)定。

對實驗樣本和對照樣本進行PCR反應，分別測定靶基因和內(nèi)參基因的Ct值。

根據(jù)內(nèi)參基因的Ct值對靶基因的Ct值進行均一化處理，以消除樣本間的差異。

計算實驗樣本中靶基因相對于對照樣本的表達量變化倍數(shù)。

三、應用與特點

絕對定量

應用：常用于食品藥品病原體檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測等需要準確測定目的基因拷貝數(shù)的場合。

特點：能夠獲得待測樣本中目的基因的準確拷貝數(shù)，后續(xù)數(shù)據(jù)處理方法簡單，但成本較高，每個基因都需購買對應的標準品。

相對定量

應用：多用于科研領域的基因表達量變化分析，如研究藥物對基因表達的影響等。

特點：不能獲取樣本中目的基因的準確拷貝數(shù)，但可以比較不同樣本中基因表達量的倍數(shù)關系。成本較低，但后續(xù)數(shù)據(jù)處理較繁瑣。

四、注意事項

絕對定量

標準品的選擇和品質(zhì)至關重要，應確保標準品與目的基因有相同的擴增效率，且標準品需拷貝數(shù)（濃度）精準、純度高。

標準曲線的繪制應滿足一定的質(zhì)量要求，如R2值應大于0.995等。

相對定量

內(nèi)參基因的選擇至關重要，需綜合考慮物種、處理條件、樣本組織來源等因素進行內(nèi)參基因選擇。

應確保實驗樣本與對照樣本的靶基因從等量原料中得到，并盡量消除操作誤差等因素對實驗結(jié)果的影響。

綜上所述，qPCR技術(shù)中的絕對定量與相對定量在定義、原理、操作步驟、應用與特點以及注意事項等方面都存在明顯的區(qū)別。在選擇使用哪種定量方法時，應根據(jù)具體的實驗需求和樣本特點進行綜合考慮。