一種微小但高效的酶基因組編輯核酸酶

當廚師開發出一種新食譜時，他們會有條不紊地添加和刪除各種食材，看看每一種食材如何改變最終的菜肴。當科學家試圖了解基因在體內的作用時，他們采用了類似的策略，即基因組編輯。目前，他們工具箱中***的工具是CRISPR，其應用范圍從癌癥治療到鐮狀細胞性貧血和β-地中海貧血等遺傳性疾病的治療然而，這種基因組編輯主食仍有其局限性。

維爾紐斯大學的基因組生物學家Tautvydas Karvelis說：“將編碼這些蛋白質的基因裝入病毒中，用于將其傳遞到細胞中，這真的很難。”即使CRISPR核酸酶直接進入細胞，它們的大蛋白質尺寸也存在局限性。例如，常用的Cas9大約有1400個氨基酸殘基長。

在最近發表在《Nature Methods》上的一項研究中，蘇黎世大學的基因組生物學家Gerald Schwank和他的團隊描述了一種微小但高效的核酸酶，它的作用和目前的一些Cas蛋白一樣好，但尺寸不到它們的一半

“這就像一種新的工具，可以用于基因組編輯，而不僅僅是一種原則，”Karvelis說，他沒有參與這項研究。

2021年，Karvelis發現了一種能夠切割DNA的緊湊RNA引導蛋白：TnpB.3與其他CRISPR核酸酶相比，TnpB要小得多，大約有400個氨基酸殘基。但TnpB的編輯效率較低，目標范圍有限。

因此，Schwank開始著手改善TnpB的業績。他和他的團隊優化了TnpB用于哺乳動物基因編輯，并設計了蛋白質的變體，以提高目標范圍。他們還建立了一個機器學習模型來預測指導RNA對一組目標序列的表現，從而為未來的用戶省去了多次試驗的麻煩。

在未改變狀態下，TnpB的編輯效率在0 - 20%之間，低于最小的CRISPR-Cas9同源物CjCas9。Schwank說：“我們問自己，我們是否真的能讓TnpB足夠高效地使用它。”

所以，團隊做了兩件事。他們優化了哺乳動物細胞TnpB的密碼子序列，并在蛋白質上附加了一個小標簽，將其引導到細胞核。研究小組觀察到，這種修飾的核酸酶的編輯效率提高了4.4倍，超過了大多數常用的RNA引導的內切酶，包括CjCas9。他們稱這種變異為TnpBmax。

當在插入哺乳動物細胞的大量靶位點文庫中進行測試時，TnpBmax表現出色，導致DNA序列的插入和缺失率約為70%。但是，任何改變DNA目標上游重要的五個堿基區域都會導致效率急劇下降。這個序列為5 ‘ TTGAT 3 ’的短區域被稱為轉座子鄰近基序（TAM），它很少出現，限制了TnpBmax發揮其魔力的地方。

為了放寬這些限制，Schwank和他的團隊測試了TnpBmax和TAM變體不同版本之間的相互作用。在第76位用丙氨酸代替賴氨酸，TnpBmax可以識別第二位置有胞嘧啶或胸腺嘧啶，第三位置有鳥嘌呤或胸腺嘧啶的TAM。這個序列在基因組中比原來的TAM多出現四次。TnpBmax或TAM的變化不影響編輯效率。

Schwank想在這個工具中加入一個額外的特性。他和他的團隊建立了一個模型，可以預測一個引導RNA序列是否能以至少70%的效率編輯給定的DNA序列。“以前，這或多或少是一場賭博。擁有TAM站點意味著，原則上，該站點應該是可定位的，但人們并不真正知道是否會有實質性的效率，”Schwank說。“現在，有了這個模型，就更容易弄清楚你是否可以使用這個工具。”

“有了這個模型，人們就可以設計自己的指南，這將有助于提高系統的可用性，”哈佛醫學院（Harvard Medical School）的基因組工程師Omar Abudayyeh說。他沒有參與這項研究。

最后，為了對該工具進行最終測試，作者將小鼠大腦和肝臟中的基因作為目標。他們觀察到編輯效率分別為65%和75%。在肝臟中，研究小組編輯了一個與膽固醇代謝有關的基因，并觀察到小鼠血液中膽固醇水平的下降。

“在他們發現的時候，TnpBs作為基因組編輯酶的效果有多大，這是一個很大的問題，”哈佛醫學院（Harvard Medical School）的基因組工程師Jonathan Gootenberg說，他沒有參與這項研究。“有了這種設計，他們真的很有競爭力。”

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