一種微小但高效的酶基因組編輯核酸酶

當(dāng)廚師開(kāi)發(fā)出一種新食譜時(shí)，他們會(huì)有條不紊地添加和刪除各種食材，看看每一種食材如何改變最終的菜肴。當(dāng)科學(xué)家試圖了解基因在體內(nèi)的作用時(shí)，他們采用了類似的策略，即基因組編輯。目前，他們工具箱中***的工具是CRISPR，其應(yīng)用范圍從癌癥治療到鐮狀細(xì)胞性貧血和β-地中海貧血等遺傳性疾病的治療然而，這種基因組編輯主食仍有其局限性。

維爾紐斯大學(xué)的基因組生物學(xué)家Tautvydas Karvelis說(shuō)：“將編碼這些蛋白質(zhì)的基因裝入病毒中，用于將其傳遞到細(xì)胞中，這真的很難。”即使CRISPR核酸酶直接進(jìn)入細(xì)胞，它們的大蛋白質(zhì)尺寸也存在局限性。例如，常用的Cas9大約有1400個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)。

在最近發(fā)表在《Nature Methods》上的一項(xiàng)研究中，蘇黎世大學(xué)的基因組生物學(xué)家Gerald Schwank和他的團(tuán)隊(duì)描述了一種微小但高效的核酸酶，它的作用和目前的一些Cas蛋白一樣好，但尺寸不到它們的一半

“這就像一種新的工具，可以用于基因組編輯，而不僅僅是一種原則，”Karvelis說(shuō)，他沒(méi)有參與這項(xiàng)研究。

2021年，Karvelis發(fā)現(xiàn)了一種能夠切割DNA的緊湊RNA引導(dǎo)蛋白：TnpB.3與其他CRISPR核酸酶相比，TnpB要小得多，大約有400個(gè)氨基酸殘基。但TnpB的編輯效率較低，目標(biāo)范圍有限。

因此，Schwank開(kāi)始著手改善TnpB的業(yè)績(jī)。他和他的團(tuán)隊(duì)優(yōu)化了TnpB用于哺乳動(dòng)物基因編輯，并設(shè)計(jì)了蛋白質(zhì)的變體，以提高目標(biāo)范圍。他們還建立了一個(gè)機(jī)器學(xué)習(xí)模型來(lái)預(yù)測(cè)指導(dǎo)RNA對(duì)一組目標(biāo)序列的表現(xiàn)，從而為未來(lái)的用戶省去了多次試驗(yàn)的麻煩。

在未改變狀態(tài)下，TnpB的編輯效率在0 - 20%之間，低于最小的CRISPR-Cas9同源物CjCas9。Schwank說(shuō)：“我們問(wèn)自己，我們是否真的能讓TnpB足夠高效地使用它。”

所以，團(tuán)隊(duì)做了兩件事。他們優(yōu)化了哺乳動(dòng)物細(xì)胞TnpB的密碼子序列，并在蛋白質(zhì)上附加了一個(gè)小標(biāo)簽，將其引導(dǎo)到細(xì)胞核。研究小組觀察到，這種修飾的核酸酶的編輯效率提高了4.4倍，超過(guò)了大多數(shù)常用的RNA引導(dǎo)的內(nèi)切酶，包括CjCas9。他們稱這種變異為TnpBmax。

當(dāng)在插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的大量靶位點(diǎn)文庫(kù)中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，TnpBmax表現(xiàn)出色，導(dǎo)致DNA序列的插入和缺失率約為70%。但是，任何改變DNA目標(biāo)上游重要的五個(gè)堿基區(qū)域都會(huì)導(dǎo)致效率急劇下降。這個(gè)序列為5 ‘ TTGAT 3 ’的短區(qū)域被稱為轉(zhuǎn)座子鄰近基序（TAM），它很少出現(xiàn)，限制了TnpBmax發(fā)揮其魔力的地方。

為了放寬這些限制，Schwank和他的團(tuán)隊(duì)測(cè)試了TnpBmax和TAM變體不同版本之間的相互作用。在第76位用丙氨酸代替賴氨酸，TnpBmax可以識(shí)別第二位置有胞嘧啶或胸腺嘧啶，第三位置有鳥(niǎo)嘌呤或胸腺嘧啶的TAM。這個(gè)序列在基因組中比原來(lái)的TAM多出現(xiàn)四次。TnpBmax或TAM的變化不影響編輯效率。

Schwank想在這個(gè)工具中加入一個(gè)額外的特性。他和他的團(tuán)隊(duì)建立了一個(gè)模型，可以預(yù)測(cè)一個(gè)引導(dǎo)RNA序列是否能以至少70%的效率編輯給定的DNA序列。“以前，這或多或少是一場(chǎng)賭博。擁有TAM站點(diǎn)意味著，原則上，該站點(diǎn)應(yīng)該是可定位的，但人們并不真正知道是否會(huì)有實(shí)質(zhì)性的效率，”Schwank說(shuō)。“現(xiàn)在，有了這個(gè)模型，就更容易弄清楚你是否可以使用這個(gè)工具。”

“有了這個(gè)模型，人們就可以設(shè)計(jì)自己的指南，這將有助于提高系統(tǒng)的可用性，”哈佛醫(yī)學(xué)院（Harvard Medical School）的基因組工程師Omar Abudayyeh說(shuō)。他沒(méi)有參與這項(xiàng)研究。

最后，為了對(duì)該工具進(jìn)行最終測(cè)試，作者將小鼠大腦和肝臟中的基因作為目標(biāo)。他們觀察到編輯效率分別為65%和75%。在肝臟中，研究小組編輯了一個(gè)與膽固醇代謝有關(guān)的基因，并觀察到小鼠血液中膽固醇水平的下降。

“在他們發(fā)現(xiàn)的時(shí)候，TnpBs作為基因組編輯酶的效果有多大，這是一個(gè)很大的問(wèn)題，”哈佛醫(yī)學(xué)院（Harvard Medical School）的基因組工程師Jonathan Gootenberg說(shuō)，他沒(méi)有參與這項(xiàng)研究。“有了這種設(shè)計(jì)，他們真的很有競(jìng)爭(zhēng)力。”

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