微生物質控之支原體快速檢測方法——qPCR法

支原體是細胞實驗室中常見的污染源，據有專家統計約有15%-35%的細胞被支原體污染。造成支原體污染的主要來源有：工作環境污染、操作者本身污染、培養基污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染、制備細胞的原始組織或器官的污染。支原體污染會改變細胞內DNA、RNA及蛋白表達，改變宿主細胞的結構和功能，影響細胞代謝和生長，具有干擾病毒復制的不利影響。
相法規及指導原則

中國藥典2020版<3301 支原體檢查法>：進行支原體檢查時，應同時進行培養法和指示細胞培養法（DNA染色法）。也可采用經國家藥品檢定機構認可的其他方法。

日本藥典（JP）14：提供三種檢測方法：1）培養法；2）指示細胞培養法；3）PCR法。

歐洲藥典（EP）2.6.7及美國藥典（USP）<63>：提供三種檢測方法：1）瓊脂和肉湯培養法；2）指示細胞培養法；3）核酸擴增技術（NAT）。（經過評估后需與前兩種方法有可比性，才可作為替代方法）

FDA：提出對于原材料、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進行支原體控制。

ICH Q5D：提出對于原材料、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進行支原體控制。

免疫細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）：對微生物污染和微生物代謝產物/衍生物污染的安全性研究，如真菌、細菌、支原體、病毒、內毒素等進行安全性研究。

細胞治療產品申請臨床試驗藥學研究和申報資料的考慮要點：病毒和細胞的載體質量標準應包括支原體等。部分支原體種類對人和動物有致病性，存在一定的生物安全風險，因此，支原體檢驗也是生物制品行業規定的必檢項目。

培養法和指示細胞法在實際應用中，存在檢測周期較長的缺點，不滿足有效期短的產品或需要快速放行的中間品。德國MB為了尋求既滿足法規檢測需求，又快速方便的檢測方式，開發了支原體檢測試劑盒qPCR法。

德國MB支原體qPCR檢測試劑盒特點：

①經典法qPCR試劑盒遵循美國藥典、歐洲藥典和日本藥典的流程要求。

②高特異性，一次檢測即可涵蓋了所有可能感染細胞的支原體物種（涵蓋歐洲藥典規定的9種支原體），根據序列一致性，至少可以檢測到107種支原體物種。操作簡單，易于觀察。

③高靈敏度，MB公司的支原體qPCR檢測試劑盒經典法最低檢測限可達到≤10CFU/ml。

④MB公司有相應配套的10CFU/100CFU的敏感度測試的標準品，便于方法學驗證。

⑤MB公司有相應配套的支原體基因組DNA和細菌基因組DNA，便于特異性驗證。

⑥MB公司有相應配套的支原體絕對定量標準品，便于最后定量檢測。