研究通過單細胞基因組測序揭示肝細胞癌的雙相拷貝數演化模型

　　胃腸病學領域學術期刊Gastroenterology以長文形式在線發表了北京大學**醫院腫瘤轉化研究中心張寧課題組的研究成果。在題為“Single cell DNA sequencing reveals punctuated and gradual clonal evolution in hepatocellular carcinoma”的研究論文中，研究人員綜合利用單細胞測序、模型構建和大規模數據及實驗驗證，系統探究了肝癌單細胞層面的基因組特征，**提出了肝癌的間斷和漸進的雙相演化模式（DPCNE），揭示了肝癌中雙相演化模式與腫瘤內內異質性以及預后的關系，**在單細胞水平證實多倍體肝癌起源于二倍體細胞，并發現了新的預后標志物CAD。這些結果為肝癌的臨床診斷、預后和治療提供了關鍵信息。

　　肝細胞癌（簡稱肝癌）約占原發性肝癌的80%，其致死率在所有癌癥中高居第三位。現有靶向治療和免疫治療在肝癌中的響應率及治療效果非常有限，而腫瘤異質性是其耐藥、復發和預后差的重要原因之一。張寧課題組近年來一直聚焦于肝癌異質性探究，通過一系列前期工作揭示了肝癌多發病灶的異質性和表型異質性（Gastroenterology，2016；Cancer Cell，2019）。然而，先前的研究多是基于組織水平的探究，這些結果只反映了不同亞克隆的平均特征，肝癌在單細胞水平的異質性仍不清楚。基因組不穩定性引起的拷貝數變異（CNA）是腫瘤異質性產生的主要來源。到目前為止，肝癌的CNA積累遵循漸進演化（GCNE）還是間斷演化（PCNE）仍缺乏探究。

　　在近期的研究中，課題組收集新鮮或冰凍的肝癌組織以及相對應的癌旁組織，通過單細胞DNA測序完成了10例肝癌患者共1275個細胞的低深度全基因組測序，對1例患者的356個細胞進行了基于倍體分析的低深度全基因組測序，并對另外3例患者共27344個細胞進行了單細胞RNA測序。而后研究人員通過17例肝癌及癌旁組織轉錄組測序、202例組織免疫組化染色、21例已發表的單細胞DNA數據和1196例已發表的RNA數據進行驗證（圖2）。

　　研究人員系統分析了10例肝癌病人中單個細胞的拷貝數變異圖譜，發現三種不同的細胞亞群：整倍體、假整倍體和異倍體。其次，研究人員通過模型構建發現CNA積累既存在間斷演化，也存在漸進演化。進一步綜合多個指標進行評估比較，研究人員發現間斷和漸進的雙相演化模式DPCNE明顯優于其他兩種模型。研究人員進一步通過3例單細胞RNA測序數據和其他癌種的單細胞DNA測序對DPCNE模型進行了驗證。這些結果表明DPCNE能更好地解釋肝癌的克隆演化模式，即腫瘤染色體不穩定的初始階段，CNA會高速率累積，短時間內獲得大量CNA，呈現間斷式演化，隨后是一個明顯的漸進演化階段，CNA數目繼續積累（圖3）。為了進一步探索肝癌中異質性與臨床特征的相關性，研究人員通過計算兩兩細胞之間的距離（PWD-CNA）評估細胞的異質性程度。基于該參數，研究人員最終發現，漸進演化階段的延長與腫瘤高異質性和病人早復發密切相關；進而通過綜合分析和研究發現，CAD蛋白可以作為肝癌潛在的預后標志物。

　　課題組還研究了倍體異質性。倍體異質性是肝癌異質性的一個重要方面，肝細胞包含二倍體或多倍體，其中多倍體占人類肝臟肝細胞的25～50%。研究人員通過流式細胞分析和單細胞測序技術，對1例肝癌病人的356個細胞進行了分析，發現在肝癌中非整倍體細胞首先起源于二倍體亞群，而后通過全基因組倍增演化為多倍體亞群，揭示了二倍體和多倍體中的非整倍體細胞具有共同的克隆起源。