E3泛素連接酶CRL2FEM1B多聚化及其發(fā)揮功能的結構基礎

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是真核細胞內重要而精細的蛋白質穩(wěn)態(tài)控制系統(tǒng)的核心組成部分之一。蛋白質泛素化降解過程主要通過三大關鍵酶類的精密協(xié)作來實施，即“泛素激活酶”（E1）、“泛素結合酶”（E2）以及“泛素連接酶”（E3）。整個泛素化過程之中，E3連接酶的角色至關重要，它負責識別特定底物，并將泛素轉移到底物上。Cullin-RING E3泛素連接酶（CRLs）是一類由催化亞基RBX、支架蛋白Cullin、底物適配蛋白和底物識別蛋白共同組裝而成的多亞基復合體。Cullin-RING E3泛素連接酶家族成員在廣泛的生物學進程和疾病中發(fā)揮著決定性作用，包括但不限于細胞增殖和還原性應激反應。在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）運作機制中，CRLs提供了一個多聚泛素化的平臺，在這個平臺上，底物特異地結合至底物識別蛋白，E2-泛素被導向至催化亞基RBX。值得注意的是，位于支架蛋白CullinN端的底物識別蛋白與其C端的催化亞基RBX之間的物理距離約為10納米。CRLs如何有效地跨越這10納米的空間將泛素從催化亞基轉移至底物上，其詳細的分子機制仍是一個有待揭示的謎團。因此，深入探究CRLs針對不同尺寸底物所采用的不同泛素化策略，將極大地促進我們對泛素化過程本質的認知。

近日，北京大學基礎醫(yī)學院系統(tǒng)生物醫(yī)學研究所尹玉新教授團隊在國際知名期刊The EMBO Journal上發(fā)表了題為“Structural Insights into the Ubiquitylation Strategy of the Oligomeric CRL2FEM1B E3 Ubiquitin Ligase”的文章，**報道了多聚形態(tài)E3泛素連接酶CRL2FEM1B在NEDD8修飾激活前，NEDD8修飾激活后與小分子量底物BEX2結合以及NEDD8修飾激活后與大分子量底物FNIP1/FLCN復合物結合的冷凍電鏡結構，從而闡明了多聚化對于CRL2FEM1B針對不同尺寸底物執(zhí)行泛素化修飾的結構基礎。

該研究首先解析了未經(jīng)NEDD8修飾（自抑制狀態(tài)）時CRL2FEM1B三聚體的冷凍電鏡結構，其中原體1作為支架穩(wěn)定地錨定住原體2的兩端，隨后原體3按照與原體2“頭對尾”的方式整合進三聚體結構中。通過質量光譜學（Mass Photometry）等多種技術手段確認，NEDD8修飾使CRL2FEM1B從三聚體轉變?yōu)槎垠w。研究進一步解析了經(jīng)NEDD8修飾激活后CRL2FEM1B二聚體與底物BEX2結合的三維結構。結果顯示，被NEDD8修飾激活的CRL2FEM1B二聚體展現(xiàn)出與自抑制狀態(tài)下的原體1和原體2相似的構象。在這種構象中，原體1為底物的識別提供了底物識別亞基，而原體2則貢獻了泛素化反應所需的催化亞基。相較于CRL2FEM1B單體，這種構象有效縮短了催化亞基與底物識別亞基之間的距離，使得泛素化效率得到顯著提升。通過突變實驗和體外泛素化反應驗證，證實了此種構象確實能大幅提升對小分子量底物BEX2的泛素化效率。

此外還解析了NEDD8修飾后CRL2FEM1B與大分子量底物FNIP1/FLCN復合物結合的結構，并結合生化實驗發(fā)現(xiàn)，FNIP1/FLCN復合物促使NEDD8激活后的CRL2FEM1B二聚體進一步解聚，然后通過多個位點的相互作用結合在CRL2FEM1B的催化亞基與底物識別亞基之間，確保泛素得以順利地催化連接至底物上。

綜上所述，此項研究通過對不同狀態(tài)下CRL2FEM1B結構的深入解析，揭示了多聚化CRL2FEM1B泛素連接酶針對不同尺寸底物的泛素化策略，完善了對CRLs泛素連接酶工作機理的認識，同時也為設計針對此類泛素連接酶的PROTAC藥物提供了堅實的結構生物學依據(jù)。

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