E3泛素連接酶CRL2FEM1B多聚化及其發揮功能的結構基礎

泛素-蛋白酶體系統是真核細胞內重要而精細的蛋白質穩態控制系統的核心組成部分之一。蛋白質泛素化降解過程主要通過三大關鍵酶類的精密協作來實施，即“泛素激活酶”（E1）、“泛素結合酶”（E2）以及“泛素連接酶”（E3）。整個泛素化過程之中，E3連接酶的角色至關重要，它負責識別特定底物，并將泛素轉移到底物上。Cullin-RING E3泛素連接酶（CRLs）是一類由催化亞基RBX、支架蛋白Cullin、底物適配蛋白和底物識別蛋白共同組裝而成的多亞基復合體。Cullin-RING E3泛素連接酶家族成員在廣泛的生物學進程和疾病中發揮著決定性作用，包括但不限于細胞增殖和還原性應激反應。在泛素-蛋白酶體系統（UPS）運作機制中，CRLs提供了一個多聚泛素化的平臺，在這個平臺上，底物特異地結合至底物識別蛋白，E2-泛素被導向至催化亞基RBX。值得注意的是，位于支架蛋白CullinN端的底物識別蛋白與其C端的催化亞基RBX之間的物理距離約為10納米。CRLs如何有效地跨越這10納米的空間將泛素從催化亞基轉移至底物上，其詳細的分子機制仍是一個有待揭示的謎團。因此，深入探究CRLs針對不同尺寸底物所采用的不同泛素化策略，將極大地促進我們對泛素化過程本質的認知。

近日，北京大學基礎醫學院系統生物醫學研究所尹玉新教授團隊在國際知名期刊The EMBO Journal上發表了題為“Structural Insights into the Ubiquitylation Strategy of the Oligomeric CRL2FEM1B E3 Ubiquitin Ligase”的文章，**報道了多聚形態E3泛素連接酶CRL2FEM1B在NEDD8修飾激活前，NEDD8修飾激活后與小分子量底物BEX2結合以及NEDD8修飾激活后與大分子量底物FNIP1/FLCN復合物結合的冷凍電鏡結構，從而闡明了多聚化對于CRL2FEM1B針對不同尺寸底物執行泛素化修飾的結構基礎。

該研究首先解析了未經NEDD8修飾（自抑制狀態）時CRL2FEM1B三聚體的冷凍電鏡結構，其中原體1作為支架穩定地錨定住原體2的兩端，隨后原體3按照與原體2“頭對尾”的方式整合進三聚體結構中。通過質量光譜學（Mass Photometry）等多種技術手段確認，NEDD8修飾使CRL2FEM1B從三聚體轉變為二聚體。研究進一步解析了經NEDD8修飾激活后CRL2FEM1B二聚體與底物BEX2結合的三維結構。結果顯示，被NEDD8修飾激活的CRL2FEM1B二聚體展現出與自抑制狀態下的原體1和原體2相似的構象。在這種構象中，原體1為底物的識別提供了底物識別亞基，而原體2則貢獻了泛素化反應所需的催化亞基。相較于CRL2FEM1B單體，這種構象有效縮短了催化亞基與底物識別亞基之間的距離，使得泛素化效率得到顯著提升。通過突變實驗和體外泛素化反應驗證，證實了此種構象確實能大幅提升對小分子量底物BEX2的泛素化效率。

此外還解析了NEDD8修飾后CRL2FEM1B與大分子量底物FNIP1/FLCN復合物結合的結構，并結合生化實驗發現，FNIP1/FLCN復合物促使NEDD8激活后的CRL2FEM1B二聚體進一步解聚，然后通過多個位點的相互作用結合在CRL2FEM1B的催化亞基與底物識別亞基之間，確保泛素得以順利地催化連接至底物上。

綜上所述，此項研究通過對不同狀態下CRL2FEM1B結構的深入解析，揭示了多聚化CRL2FEM1B泛素連接酶針對不同尺寸底物的泛素化策略，完善了對CRLs泛素連接酶工作機理的認識，同時也為設計針對此類泛素連接酶的PROTAC藥物提供了堅實的結構生物學依據。

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